真菌(1,3)-β-D-葡聚糖多克隆抗体制备及ELISA竞争法检测体系的建立

doi:10.3969/j.issn.1673-8640.2015.09.015

检验医学 ›› 2015, Vol. 30 ›› Issue (9): 931-933.DOI: 10.3969/j.issn.1673-8640.2015.09.015

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真菌(1,3)-β-D-葡聚糖多克隆抗体制备及ELISA竞争法检测体系的建立

严俊¹, 杨葳², 翟栓柱¹, 薛知信¹, 郁彭¹, 周泽奇¹

1.天津科技大学生物工程学院,天津 300457
2.天津市医疗器械技术审评中心,天津 300070

收稿日期:2015-02-25 出版日期:2015-09-30 发布日期:2015-09-29
作者简介:null
作者简介:严俊,男,1987年生,硕士,主要从事临床微生物疾病早期诊断研究。

Preparation of polyclonal antibody and development of a competitive ELISA for fungal (1,3)-beta-D-glucan

YAN Jun¹, YANG Wei², ZHAI Shuanzhu¹, XUE Zhixin¹, YU Peng¹, ZHOU Zeqi¹

1. College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China
2.Tianjin Medical Instrument Technical Evaluation Center, Tianjin 300070, China

Received:2015-02-25 Online:2015-09-30 Published:2015-09-29

摘要/Abstract

摘要： 目的

建立高特异性和敏感性的(1,3)-β-D-葡聚糖酶联免疫吸附试验(ELISA)检测体系。

方法

经蛋白修饰的(1,3)-β-D-葡聚糖和真菌提取物作为免疫原制备兔多克隆抗体,并对高效价交叉反应弱的抗体进行纯化和辣根过氧化物酶(HRP)标记,最后建立真菌(1,3)-β-D-葡聚糖ELISA竞争法检测体系。

结果

建立的ELISA竞争法检测体系线性范围为3.125~200 pg/mL。添加100、25和6.25 pg/mL抗原的血清回收率为97.8%~113.6%,重复试验的变异系数<15%。该检测体系能有效地从血清样本中检出低浓度的烟曲霉、白念珠菌和高浓度的隐球菌,并且对结核分枝杆菌、大肠埃希菌、沙门氏菌、克雷伯菌和金黄色葡萄球菌5种细菌抗干扰能力强。

结论

利用(1,3)-β-D-葡聚糖作为包被抗原,酶标抗体HRP-Ab3B作为检测抗体,成功建立了(1,3)-β-D-葡聚糖ELISA竞争法检测体系。

关键词: (1,3)-β-D-葡聚糖, 酶联免疫吸附试验, 侵袭性真菌病

Abstract: Objective

To develop a competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) with high specificity and sensitivity for fungal (1,3)-beta-D-glucan.

Methods

Rabbit polyclonal antibody was produced by immunization with protein-conjugated (1,3)-beta-D-glucan and fungal extract. The highest titer and little cross-reactivity polyclonal antibody was labeled with horseradish peroxidase (HRP) and purified. Finally, a competitive ELISA was established for fungal (1,3)-beta-D-glucan.

Results

The linear range was 3.125-200 pg/mL. The recovery range for 100, 25 and 6.25 pg/mL serum antigen was 97.8%-113.6%, and the coefficient of variation for repeated test was <15%. The detection system could effectively detect low concentrations of Aspergillus fumigatus and Candida albicans and high concentration of Cryptococcus neoformans from serum samples. Meanwhile, the detection system demonstrated little interference against 5 kinds of pathogenic bacteria, including Mycobacterium tuberculosis, Escherichia coli, Salmonella, Klebsiella and Staphylococcus aureus.

Conclusions

A competitive ELISA is developed successfully for the detection of invasive fungal disease with (1,3)-beta-D-glucan used as a coated antigen and enzyme-labeled antibody HRP-Ab3B used as a detection antibody.

Key words: (1,3)-beta-D-glucan, Enzyme-linked immunosorbent assay, Invasive fungal disease

中图分类号:

R446.61

严俊, 杨葳, 翟栓柱, 薛知信, 郁彭, 周泽奇. 真菌(1,3)-β-D-葡聚糖多克隆抗体制备及ELISA竞争法检测体系的建立[J]. 检验医学, 2015, 30(9): 931-933.

YAN Jun, YANG Wei, ZHAI Shuanzhu, XUE Zhixin, YU Peng, ZHOU Zeqi. Preparation of polyclonal antibody and development of a competitive ELISA for fungal (1,3)-beta-D-glucan[J]. Laboratory Medicine, 2015, 30(9): 931-933.

图/表 3

图1 多克隆抗体Ab-3B电泳图

图2 ELISA竞争法的标准曲线验证注:■第1次,Y=1.44-0.389lgX,r2=0.991; ●第2次,Y=1.37-0.357lgX,r2=0.989; ▲第3次,Y=1.27-0.356lgX,r2=0.993

表1 菌体干粉添加到血清ELISA竞争法检测结果对比(pg/mL)

菌种	血清样本中菌粉浓度(μg/mL)
菌种	10	1	0.1	0.01	0.001	0.000 1
烟曲霉	>200	>200	>200	>200	127.6±10.1	10.3±1.2
白念珠菌	>200	>200	>200	>200	88.3±8.9	9.2±0.7
隐球菌	>200	78.5±8.1	6.8±0.7	<3.125	<3.125	<3.125

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真菌(1,3)-β-D-葡聚糖多克隆抗体制备及ELISA竞争法检测体系的建立

Preparation of polyclonal antibody and development of a competitive ELISA for fungal (1,3)-beta-D-glucan

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