检验医学 ›› 2020, Vol. 35 ›› Issue (12): 1207-1212.DOI: 10.3969/j.issn.1673-8640.2020.12.002
收稿日期:
2020-02-24
出版日期:
2020-12-30
发布日期:
2020-12-31
作者简介:
null基金资助:
LIU Chunchen, LIN Huixian, ZHENG Lei()
Received:
2020-02-24
Online:
2020-12-30
Published:
2020-12-31
摘要:
细胞外囊泡(EV)是细胞分泌至胞外的一种亚细胞成分,可运载众多信号分子,参与机体众多生理病理活动。对EV及其内容物的检测和分析有利于从细胞、亚细胞以及分子水平解析疾病,对疾病相关机制的基础研究及其临床应用有重要价值。文章综述了EV检测技术的研究进展,总结了各类方法的优缺点,评价其临床应用价值,并对未来发展趋势进行展望。
中图分类号:
刘春辰, 林慧娴, 郑磊. 细胞外囊泡检测技术及其临床应用进展[J]. 检验医学, 2020, 35(12): 1207-1212.
LIU Chunchen, LIN Huixian, ZHENG Lei. Research progress in extracellular vesicle detection technique and its clinical application[J]. Laboratory Medicine, 2020, 35(12): 1207-1212.
分类 | 检测技术名称 | 优点 | 缺点 |
---|---|---|---|
分离富集 | 超速离心法[ | 操作简单,可用于大批量样本 | 所需设备昂贵,耗时,离心力过大或重复离心 均可影响EV的完整性 |
密度梯度离心法[ | 分离纯度提高,可较好保持EV 活性 | 耗时,配制惰性梯度介质时需把握其渗透压 | |
尺寸排阻色谱法[ | 分离纯度进一步提高,省时, 可较好保持EV活性 | 层析柱使用次数与上样量有限制,部分样本中 的脂蛋白可能与EV共分离 | |
超滤法[ | 操作简单,省时,可较好保持 EV活性 | 无法滤除小于滤膜孔径的杂质;样本需经前处 理去除细胞等大的膜状结构,避免其经过滤 膜时分解形成小囊泡,影响纯度与后续分析 | |
聚乙二醇沉淀法[ | 试剂易得,操作较简单 | 耗时,易受其他疏水蛋白质干扰,影响EV后续 蛋白功能分析 | |
免疫磁珠分选法[ | 特异性好,纯度高 | 成本较高;受抗体制备技术限制;抗原表位可 被激活或屏蔽,影响后续的功能分析 | |
鉴定 | 透射电子显微镜[ 子显微镜[ 微镜[ 等 | 可用于EV形态学特征鉴定,透 射电子显微镜可获取EV内部 的结构特征,原子力显微镜 可提供EV的三维表面图 | 对设备要求高,样本制备复杂,脱水固定以及 染色可能影响EV活性,成本高 |
纳米颗粒跟踪分析[ | 可获取EV实时浓度与粒径分布 信息 | 无法区分EV表型与来源,无法将EV与粒径相 似的粒子相区分;不适合非均质样本,大颗 粒光强信号易掩盖小颗粒信号 | |
免疫印迹法[ | 可对目标蛋白进行定性、半定 量或定量分析,特异性强 | 只能对已知蛋白进行检测,受抗体制备技术限 制,操作较繁琐、耗时 |
表1 EV常用的分离富集与鉴定技术及其优缺点
分类 | 检测技术名称 | 优点 | 缺点 |
---|---|---|---|
分离富集 | 超速离心法[ | 操作简单,可用于大批量样本 | 所需设备昂贵,耗时,离心力过大或重复离心 均可影响EV的完整性 |
密度梯度离心法[ | 分离纯度提高,可较好保持EV 活性 | 耗时,配制惰性梯度介质时需把握其渗透压 | |
尺寸排阻色谱法[ | 分离纯度进一步提高,省时, 可较好保持EV活性 | 层析柱使用次数与上样量有限制,部分样本中 的脂蛋白可能与EV共分离 | |
超滤法[ | 操作简单,省时,可较好保持 EV活性 | 无法滤除小于滤膜孔径的杂质;样本需经前处 理去除细胞等大的膜状结构,避免其经过滤 膜时分解形成小囊泡,影响纯度与后续分析 | |
聚乙二醇沉淀法[ | 试剂易得,操作较简单 | 耗时,易受其他疏水蛋白质干扰,影响EV后续 蛋白功能分析 | |
免疫磁珠分选法[ | 特异性好,纯度高 | 成本较高;受抗体制备技术限制;抗原表位可 被激活或屏蔽,影响后续的功能分析 | |
鉴定 | 透射电子显微镜[ 子显微镜[ 微镜[ 等 | 可用于EV形态学特征鉴定,透 射电子显微镜可获取EV内部 的结构特征,原子力显微镜 可提供EV的三维表面图 | 对设备要求高,样本制备复杂,脱水固定以及 染色可能影响EV活性,成本高 |
纳米颗粒跟踪分析[ | 可获取EV实时浓度与粒径分布 信息 | 无法区分EV表型与来源,无法将EV与粒径相 似的粒子相区分;不适合非均质样本,大颗 粒光强信号易掩盖小颗粒信号 | |
免疫印迹法[ | 可对目标蛋白进行定性、半定 量或定量分析,特异性强 | 只能对已知蛋白进行检测,受抗体制备技术限 制,操作较繁琐、耗时 |
内容物 | 检测技术名称 | 标志物 | 疾病类型 | 优点 |
---|---|---|---|---|
核酸 | 基于多色荧光PCR的EV- lncRNA分析芯片[ | SLC9A3-AS1、PCAT6 | 肺癌 | 多重检测低水平EV的lncRNA,检测限为 10 拷贝/μL |
功能化金纳米荧光探 针[ | miRNA-1246 | 乳腺癌 | 仅需40 μL样本;可用于区分乳腺癌患者与健康 人(敏感性为100.0%,特异性为92.9%) | |
免疫生物芯片[ | miRNA-21、TTF-1 mRNA | 非小细胞肺癌 | 所需样本量少(30 μL)、耗时少(4 h),可用 于肺癌诊断 | |
NanoVilli芯片[ | EGFR、ROS1 | 非小细胞肺癌 | EV富集仅需30 min,可联合实时定量数字PCR 完成mRNA分析;可用于肺癌ROS1重排及 EGFRT790M突变监测 | |
蛋白质 | 外泌体双膜蛋白共表达 检测平台[ | CD63、 EpCAM | 乳腺癌 | 可用于区分乳腺癌来源与正常乳腺上皮来源的 外泌体 |
液滴数字ExoELISA[ | GPC-1 | 乳腺癌 | 检测限为10~17 mol,可用于靶外泌体的绝对计数 | |
荧光生物传感台[ | CD63、核仁素 | 白血病 | 灵敏度和特异性均较高,可检测浓度为100个/μL 的外泌体 | |
放大SAW传感器[ | CD63、 EpCAM | 检测限达1.2×103个/mL,用时短(30 min) | ||
Aptasensor[ | CD63、 MUC1 | 胃癌 | 可检测低至9.54×102个/mL的靶外泌体,可应用 于胃癌的诊断与预后评估 | |
Exodisc-B/P[ | CD9、CD81、CD63、 PSA、PSMA、 HSP90、EpCAM、 EGFR | 前列腺癌等 | 样本用量为30 μL,EV捕获率高达75%,纯度与 产量均高于传统超速离心法,可用于前列腺 癌的辅助诊断及动物模型的肿瘤进展监测 | |
脂质 | 基于激光镊子拉曼光谱 的检测平台[ | 胆固醇、磷脂等 | 不需标记,可保持外泌体活性,使单个外泌体 水平的检测成为可能 | |
高通量质谱分析[ | PS(18:1/18:1)、 PS(18:0-18: 2)、LacCer(d18: 1/16:0)等 | 前列腺癌 | LacCer(d18:1/16:0) /PS(18:1/18:1)比 值与PS(18:0-18:2)/PS(18:1/18:1) 比值联合检测区分前列腺癌与健康人的敏感 性为93%、特异性为100% |
表2 EV内容物检测新技术
内容物 | 检测技术名称 | 标志物 | 疾病类型 | 优点 |
---|---|---|---|---|
核酸 | 基于多色荧光PCR的EV- lncRNA分析芯片[ | SLC9A3-AS1、PCAT6 | 肺癌 | 多重检测低水平EV的lncRNA,检测限为 10 拷贝/μL |
功能化金纳米荧光探 针[ | miRNA-1246 | 乳腺癌 | 仅需40 μL样本;可用于区分乳腺癌患者与健康 人(敏感性为100.0%,特异性为92.9%) | |
免疫生物芯片[ | miRNA-21、TTF-1 mRNA | 非小细胞肺癌 | 所需样本量少(30 μL)、耗时少(4 h),可用 于肺癌诊断 | |
NanoVilli芯片[ | EGFR、ROS1 | 非小细胞肺癌 | EV富集仅需30 min,可联合实时定量数字PCR 完成mRNA分析;可用于肺癌ROS1重排及 EGFRT790M突变监测 | |
蛋白质 | 外泌体双膜蛋白共表达 检测平台[ | CD63、 EpCAM | 乳腺癌 | 可用于区分乳腺癌来源与正常乳腺上皮来源的 外泌体 |
液滴数字ExoELISA[ | GPC-1 | 乳腺癌 | 检测限为10~17 mol,可用于靶外泌体的绝对计数 | |
荧光生物传感台[ | CD63、核仁素 | 白血病 | 灵敏度和特异性均较高,可检测浓度为100个/μL 的外泌体 | |
放大SAW传感器[ | CD63、 EpCAM | 检测限达1.2×103个/mL,用时短(30 min) | ||
Aptasensor[ | CD63、 MUC1 | 胃癌 | 可检测低至9.54×102个/mL的靶外泌体,可应用 于胃癌的诊断与预后评估 | |
Exodisc-B/P[ | CD9、CD81、CD63、 PSA、PSMA、 HSP90、EpCAM、 EGFR | 前列腺癌等 | 样本用量为30 μL,EV捕获率高达75%,纯度与 产量均高于传统超速离心法,可用于前列腺 癌的辅助诊断及动物模型的肿瘤进展监测 | |
脂质 | 基于激光镊子拉曼光谱 的检测平台[ | 胆固醇、磷脂等 | 不需标记,可保持外泌体活性,使单个外泌体 水平的检测成为可能 | |
高通量质谱分析[ | PS(18:1/18:1)、 PS(18:0-18: 2)、LacCer(d18: 1/16:0)等 | 前列腺癌 | LacCer(d18:1/16:0) /PS(18:1/18:1)比 值与PS(18:0-18:2)/PS(18:1/18:1) 比值联合检测区分前列腺癌与健康人的敏感 性为93%、特异性为100% |
[1] | LIU J,MA J,TANG K,et al.Therapeutic use of tumor cell-derived extracellular vesicles[J]. Methods Mol Biol,2017,1660:433-440. |
[2] | URBANELLI L,BURATTA S,TANCINI B,et al.The role of extracellular vesicles in viral infection and transmission[J]. Vaccines(Basel),2019,7(3):102. |
[3] | 黄依瑶,郑磊. 重视外泌体的实验诊断价值[J]. 中华检验医学杂志,2015,38(11):724-726. |
[4] | SHAO H,IM H,CASTRO C M,et al.New technologies for analysis of extracellular vesicles[J]. Chem Rev,2018,118(4):1917-1950. |
[5] | 安泰学,郑磊. 细胞外囊泡的分析方法及临床应用进展[J]. 南方医科大学学报,2017,37(11):1559-1563. |
[6] | TIAN Y,GONG M,HU Y,et al.Quality and efficiency assessment of six extracellular vesicle isolation methods by nano-flow cytometry[J]. J Extracell Vesicles,2020,9(1):1697028. |
[7] | THÉRY C,WITWER K W,AIKAWA E,et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018(MISEV2018):a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines[J]. J Extracell Vesicles,2018,7(1):1535750. |
[8] | KONTOPOULOU E,STRACHAN S,REINHARDT K,et al.Evaluation of dsDNA from extracellular vesicles(EV) in pediatric AML diagnostics[J]. Ann Hematol,2020,99(3):459-475. |
[9] | IWAI K,YAMAMOTO S,YOSHIDA M,et al.Isolation of extracellular vesicles in saliva using density gradient ultracentrifugation[J]. Methods Mol Biol,2017,1660:343-350. |
[10] | MONGUIÓ-TORTAJADA M,GÁLVEZ-MONTÓN C,BAYES-GENIS A,et al. Extracellular vesicle isolation methods:rising impact of size-exclusion chromatography[J]. Cell Mol Life Sci,2019,76(12):2369-2382. |
[11] | BRZOZOWSKI J S,BOND D R,JANKOWSKI H,et al.Extracellular vesicles with altered tetraspanin CD9 and CD151 levels confer increased prostate cell motility and invasion[J]. Sci Rep,2018,8(1):8822. |
[12] | LV C Y,DING W J,WANG Y L,et al.A PEG-based method for the isolation of urinary exosomes and its application in renal fibrosis diagnostics using cargo miR-29c and miR-21 analysis[J]. Int Urol Nephrol,2018,50(5):973-982. |
[13] | OKSVOLD M P,NEURAUTER A,PEDERSEN K W.Magnetic bead-based isolation of exosomes[J]. Methods Mol Biol,2015,1218:465-481. |
[14] | JONG A Y,WU C H,LI J,et al.Large-scale isolation and cytotoxicity of extracellular vesicles derived from activated human natural killer cells[J]. J Extracell Vesicles,2017,6(1):1294368. |
[15] | ZHOU D,ZHAI W,ZHANG M.Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles promote apoptosis in RSC96 Schwann cells through the activation of the ERK pathway[J]. Int J Clin Exp Pathol,2018,11(11):5157-5170. |
[16] | EMELYANOV A,SHTAM T,KAMYSHINSKY R,et al.Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles from cerebrospinal fluid[J]. PLoS One,2020,15(1):e0227949. |
[17] | SKLIAR M,CHERNYSHEV V S.Imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy[J]. J Vis Exp,2019(151):e59254. |
[18] | FAFIÁN-LABORA J,MORENTE-LÓPEZ M,SÁNCHEZ-DOPICO M J,et al. Influence of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in vitro and their role in ageing[J]. Stem Cell Res Ther,2020,11(1):13. |
[19] | NGUYEN M A,KARUNAKARAN D,GEOFFRION M,et al.Extracellular vesicles secreted by atherogenic macrophages transfer microrna to inhibit cell migration[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2018,38(1):49-63. |
[20] | BÁNOVÁ V R,ZDURIENÍKOVÁ M,TYIAKOVÁ S,et al. Silencing of carbonic anhydrase I enhances the malignant potential of exosomes secreted by prostatic tumour cells[J]. J Cell Mol Med,2019,23(5):3641-3655. |
[21] | VAN NIEL G,D'ANGELO G,RAPOSO G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles[J]. Nat Rev Mol Cell Biol,2018,19(4):213-228. |
[22] | WORST T S,PREVITI C,NITSCHKE K,et al.miR-10a-5p and miR-29b-3p as extracellular vesicle-associated prostate cancer detection markers[J]. Cancers(Basel),2020,12(1):43. |
[23] | YEKULA A,MINCIACCHI V R,MORELLO M,et al.Large and small extracellular vesicles released by glioma cells in vitro and in vivo[J]. J Extracell Vesicles,2020,9(1):1689784. |
[24] | BAI Y,QU Y,WU Z,et al.Absolute quantification and analysis of extracellular vesicle lncRNAs from the peripheral blood of patients with lung cancer based on multi-colour fluorescence chip-based digital PCR[J]. Biosens Bioelectron,2019,142:111523. |
[25] | ZHAI L Y,LI M X,PAN W L,et al.In situ detection of plasma exosomal microrna-1246 for breast cancer diagnostics by a Au nanoflare probe[J]. ACS Appl Mater Interfaces,2018,10(46):39478-39486. |
[26] | YANG Y,KANNISTO E,YU G,et al.An immuno-biochip selectively captures tumor-derived exosomes and detects exosomal RNAs for cancer diagnosis[J]. ACS Appl Mater Interfaces,2018,10(50):43375-43386. |
[27] | DONG J,ZHANG R Y,SUN N,et al.Bio-inspired nanovilli chips for enhanced capture of tumor-derived extracellular vesicles:toward non-invasive detection of gene alterations in non-small cell lung cancer[J]. ACS Appl Mater Interfaces,2019,11(15):13973-13983. |
[28] | RAHMAN M M,SHIMIZU K,YAMAUCHI M,et al.Acidification effects on isolation of extracellular vesicles from bovine milk[J]. PLoS One,2019,14(9):e0222613. |
[29] | STRØMME O,PSONKA-ANTONCZYK K M,STOKKE B T,et al. Myeloma-derived extracellular vesicles mediate HGF/c-Met signaling in osteoblast-like cells[J]. Exp Cell Res,2019,383(1):111490. |
[30] | NOLAN J P,DUGGAN E.Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry[J]. Methods Mol Biol,2018,1678:79-92. |
[31] | LEITOLIS A,SUSS P H,RODERJAN J G,et al.Human heart explant-derived extracellular vesicles:characterization and effects on the in vitro recellularization of decellularized heart valves[J]. Int J Mol Sci,2019,20(6):1279. |
[32] | SHEN W,GUO K,ADKINS G B,et al.A single extracellular vesicle(EV) flow cytometry approach to reveal EV heterogeneity[J]. Angew Chem Int Ed Engl,2018,57(48):15675-15680. |
[33] | TIAN Y,MA L,GONG M,et al.Protein profiling and sizing of extracellular vesicles from colorectal cancer patients via flow cytometry[J]. ACS Nano,2018,12(1):671-680. |
[34] | 陈贤华,潘炜伦,李博,等. 外泌体双膜蛋白共表达检测平台:基于磁性分离和催化发夹组装[J]. 南方医科大学学报,2019,39(12):1453-1460. |
[35] | LIU C,XU X,LI B,et al.Single-exosome-counting immunoassays for cancer diagnostics[J]. Nano Lett,2018,18(7):4226-4232. |
[36] | HUANG L,WANG D B,SINGH N,et al.A dual-signal amplification platform for sensitive fluorescence biosensing of leukemia-derived exosomes[J]. Nanoscale,2018,10(43):20289-20295. |
[37] | WANG C,WANG C,JIN D,et al.AuNP-amplified surface acoustic wave sensor for the quantification of exosomes[J]. ACS Sens,2020,5(2):362-369. |
[38] | HUANG R,HE L,XIA Y,et al.A sensitive aptasensor based on a hemin/G-quadruplex-assisted signal amplification strategy for electrochemical detection of gastric cancer exosomes[J]. Small,2019,15(19):e1900735. |
[39] | SUNKARA V,KIM C J,PARK J,et al.Fully automated,label-free isolation of extracellular vesicles from whole blood for cancer diagnosis and monitoring[J]. Theranostics,2019,9(7):1851-1863. |
[40] | MIHÁLY J,DEÁK R,SZIGYÁRTÓ I C,et al.Characterization of extracellular vesicles by IR spectroscopy:fast and simple classification based on amide and CH stretching vibrations[J]. Biochim Biophys Acta Biomembr,2017,1859(3):459-466. |
[41] | BENMOUSSA A,LY S,SHAN S T,et al.A subset of extracellular vesicles carries the bulk of microRNAs in commercial dairy cow's milk[J]. J Extracell Vesicles,2017,6(1):1401897. |
[42] | SKOTLAND T,EKROOS K,KAUHANEN D,et al.Molecular lipid species in urinary exosomes as potential prostate cancer biomarkers[J]. Eur J Cancer,2017,70:122-132. |
[43] | SMITH Z J,LEE C,ROJALIN T,et al.Single exosome study reveals subpopulations distributed among cell lines with variability related to membrane content[J]. J Extracell Vesicles,2015,4:28533. |
[1] | 周韵斓, 沈立松. 液体活检标志物在非小细胞肺癌中的临床应用和挑战[J]. 检验医学, 2023, 38(9): 807-811. |
[2] | 孙泽朋, 王洪彬, 王建东, 宋德伟, 肖鹏. 心肌损伤多肽和蛋白类标志物方法学分析和进展[J]. 检验医学, 2023, 38(8): 784-789. |
[3] | 张敏, 王彬宇, 迟伟群, 刘禹. 外泌体非编码RNA作为疾病诊断生物标志物的研究进展[J]. 检验医学, 2023, 38(6): 594-598. |
[4] | 刘庆阳, 袁建明, 夏进军, 姜风英, 王秋波, 王晓明. 基于GEO数据库和临床样本验证CXCL9作为类风湿关节炎生物标志物的研究[J]. 检验医学, 2023, 38(12): 1121-1129. |
[5] | 周福荣, 李龑杼, 刘勇敢. lncRNA SNP在结直肠癌易感性预测和预后评估中的应用[J]. 检验医学, 2023, 38(12): 1206-1210. |
[6] | 鲁启源, 卢建华. 人工关节假体周围感染诊断生物标志物研究进展[J]. 检验医学, 2023, 38(10): 997-1002. |
[7] | 陈雪薇, 李一荣. 基于GEO数据库筛选代谢综合征潜在生物标志物[J]. 检验医学, 2023, 38(1): 32-38. |
[8] | 吴亚婷, 李卓林, 雷艳, 贾如雪, 张胜行, 王水良. 尿液中miRNA作为常见恶性肿瘤生物标志物研究进展[J]. 检验医学, 2023, 38(1): 94-99. |
[9] | 王芮, 李朝燕, 赵爱光. 循环肿瘤DNA检测在胃癌诊疗中的应用现状[J]. 检验医学, 2022, 37(9): 877-881. |
[10] | 邬燕倩, 俞翀, 沈鹭, 郑浩然, 洪叶挺. 体液piRNA作为疾病潜在生物标志物的研究进展[J]. 检验医学, 2022, 37(8): 782-786. |
[11] | 冯雪晴, 居漪, 李卿, 金中淦. 电化学适配体传感器检测生物标志物研究进展[J]. 检验医学, 2022, 37(5): 477-482. |
[12] | 高东田, 刘利华, 申爱华, 孙寅. 侵袭性肺曲霉菌感染实验诊断新进展[J]. 检验医学, 2021, 36(4): 453-461. |
[13] | 张万乾, 王想福, 任有亮, 郑卉卉. 肝素结合蛋白在感染性疾病中的应用研究进展[J]. 检验医学, 2021, 36(11): 1186-1189. |
[14] | 杜晶辉, 李莎, 刘旭. 新型冠状病毒肺炎诊断的相关实验室检测技术应用[J]. 检验医学, 2020, 35(8): 843-848. |
[15] | 王茜青, 洪娟, 杜超, 褚庆华. 血清组织蛋白酶D检测在非酒精性脂肪性肝病中的临床意义[J]. 检验医学, 2020, 35(6): 578-582. |
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