检验医学 ›› 2021, Vol. 36 ›› Issue (4): 430-436.DOI: 10.3969/j.issn.1673-8640.2021.04.017
郭平, 孙潇智, 刘玉杰, 李资益, 杨婧, 管恒毓, 廖兵()
收稿日期:
2020-09-24
出版日期:
2021-04-30
发布日期:
2021-04-28
通讯作者:
廖兵
作者简介:
廖 兵,E-mail: liaobing@shsmu.edu.cn。郭平与孙潇智对本研究具有同等贡献,并列为第一作者。
基金资助:
GUO Ping, SUN Xiaozhi, LIU Yujie, LI Ziyi, YANG Jing, GUAN Hengyu, LIAO Bing()
Received:
2020-09-24
Online:
2021-04-30
Published:
2021-04-28
Contact:
LIAO Bing
摘要:
目的 探讨WW结构域的E3泛素蛋白连接酶1(WWP1)和E3泛素蛋白连接酶2(WWP2)对3种转录因子[八聚体结合转录因子4(OCT4)、性别决定区Y-box蛋白2(SOX2)和NANOG蛋白]水平的影响。方法 通过质粒转染,在HEK 293FT细胞中分别共表达OCT4、SOX2、NANOG和WWP1或WWP2。通过免疫印迹法检测WWP1或WWP2过表达对OCT4、SOX2、NANOG蛋白水平的影响。通过GST pull-down实验和免疫共沉淀实验分析WWP1与SOX2蛋白间的相互作用;运用体外蛋白质泛素化修饰实验证明WWP1是否为SOX2的特异E3泛素连接酶。结果 在WWP1与OCT4、WWP1与SOX2及WWP2与OCT4共表达体系中,WWP1或WWP2均呈剂量依赖性地下调对应的共表达蛋白OCT4或SOX2水平,且以WWP1与SOX2共表达体系中SOX2蛋白的表达下调最为明显。在其他共表达体系中,WWP1或WWP2对对应的共表达蛋白均无明显的下调作用。溶酶体抑制剂氯喹可部分阻止SOX2蛋白水平的降低。放线菌酮(CHX)处理24 h后,WWP1与SOX2共表达体系中的SOX2蛋白水平的下降速度快于单独过表达SOX2(P<0.05)。WWP1可以通过与SOX2蛋白的直接相互作用催化SOX2蛋白的泛素化修饰。结论 WWP1是SOX2蛋白新的E3泛素连接酶,可促进SOX2蛋白经泛素-溶酶体途径降解,进而下调SOX2蛋白的表达。
中图分类号:
郭平, 孙潇智, 刘玉杰, 李资益, 杨婧, 管恒毓, 廖兵. E3泛素连接酶1对SOX2蛋白稳定性的影响[J]. 检验医学, 2021, 36(4): 430-436.
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图1 WWP1和WWP2对OCT4、SOX2、NANOG蛋白相对表达量的影响 注:(a)WWP1与OCT4共表达体系的免疫印迹法检测结果;(b)WWP1与OCT4共表达体系中各蛋白的相对表达量;(c)WWP1与SOX2共表达体系的免疫印迹法检测结果;(d)WWP1与SOX2共表达体系中各蛋白的相对表达量;(e)WWP1与NANOG共表达体系的免疫印迹法检测结果;(f)WWP1与NANOG共表达体系中各蛋白的相对表达量;(g)WWP2与OCT4共表达体系的免疫印迹法检测结果;(h)WWP2与OCT4共表达体系中各蛋白的相对表达量;(i)WWP2与SOX2共表达体系的免疫印迹法检测结果;(j)WWP2与SOX2共表达体系中各蛋白的相对表达量;(k)WWP2与NANOG共表达体系的免疫印迹法检测结果;(l)WWP2与NANOG共表达体系中各蛋白的相对表达量; 0 μg; 0.2 μg; 0.4 μg; 0.8 μg。
图2 CHX处理不同时间对照体系及WPP1与SOX2共表达体系中SOX2蛋白的变化 注:(a)CHX处理8、16、24 h和未处理细胞(0 h)中SOX2蛋白的变化;(b)CHX处理不同时间后各体系中SOX2蛋白的相对表达量;■ 对照体系;□ WWP1与SOX2共表达体系;(c)CHX处理不同时间后SOX2蛋白的半衰期曲线; ● 对照体系; ■ WWP1与SOX2共表达体系;与对照体系比较,*P<0.05。
图4 GST-WWP1、GST-WWP1-C890A 和His-SOX2重组融合蛋白考马斯亮蓝染色结果 注:M为Marker;1为GST-WWP1重组融合蛋白;2为GST-WWP1-C890A重组融合蛋白;3为His-SOX2重组融合蛋白;红色箭头示GST-WWP1和GST-WWP1-C890A重组融合蛋白;黑色箭头示His-SOX2重组融合蛋白。
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