结直肠癌患者血浆cfDNA检测方法的建立及临床应用评估

doi:10.3969/j.issn.1673-8640.2022.06.013

检验医学 ›› 2022, Vol. 37 ›› Issue (6): 561-567.DOI: 10.3969/j.issn.1673-8640.2022.06.013

结直肠癌患者血浆cfDNA检测方法的建立及临床应用评估

朱赟洁, 马峥尧, 沈敏娜, 周琰, 黄斐, 陈馨宁, 张春燕, 王蓓丽, 郭玮()

复旦大学附属中山医院检验科,上海 200032

收稿日期:2021-11-17 修回日期:2022-03-04 出版日期:2022-06-30 发布日期:2022-07-28
通讯作者: 郭玮
作者简介:郭玮,E-mail： guo.wei@zs-hospital.sh.cn。
朱赟洁,女,1998年生,学士,技师,主要从事分子诊断工作;
马峥尧,男,1971年生,学士,主管技师,主要从事临床检验工作。第一联系人：朱赟洁与马峥尧对本研究具有同等贡献,并列为第一作者。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81772263);国家自然科学基金面上项目(81972000);国家自然科学基金青年项目(81902139);复旦大学附属中山医院临床研究专项基金(2018ZSLC05)

Establishment and clinical application evaluation of plasma cfDNA determination in colorectal cancer patients

ZHU Yunjie, MA Zhengyao, SHEN Minna, ZHOU Yan, HUANG Fei, CHEN Xinning, ZHANG Chunyan, WANG Beili, GUO Wei()

Department of Clinical Laboratory,Zhongshan Hospital,Fudan University,Shanghai 200032,China

Received:2021-11-17 Revised:2022-03-04 Online:2022-06-30 Published:2022-07-28
Contact: GUO Wei

摘要/Abstract

摘要：

目的建立基于下一代测序（NGS）平台的检测结直肠癌患者血浆循环游离DNA（cfDNA）的方法,并进行性能确认和临床应用评价。方法在NGS平台上构建测定结直肠癌患者血浆cfDNA的检测系统（简称结直肠癌cfDNA panel）。对结直肠癌cfDNA panel的准确性、精确性、可用于抽提的最少样本量和投入量、分析灵敏度、分析特异性等性能指标进行评估。比较结直肠癌cfDNA panel与Miseq Dx二代测序平台及突变扩增阻滞系统（ARMS）（肿瘤组织样本）的一致性。结果结直肠癌cfDNA panel的准确性为99.97%,对预期突变的检出率为100%。可用于血浆抽提的样本起始量为1 mL,cfDNA投入量为10 ng,分析灵敏度为0.2%。10 000 mg/L血红蛋白、500 mg/L胆红素或2%脂肪乳对结直肠癌cfDNA panel抽提无影响。结直肠癌cfDNA panel与Miseq Dx二代测序平台和ARMS（肿瘤组织样本）的一致性分别为94.12%和90.91%,结直肠癌cfDNA panel与Miseq Dx二代测序平台检测KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA的阳性符合率和阴性符合率分别为100%和99.60%。结论结直肠癌cfDNA panel的检测性能符合临床应用要求,且血浆cfDNA结果与肿瘤组织结果高度一致,可作为组织活检的有益补充。

关键词: 循环游离DNA, 结直肠癌, 下一代测序, 实验室自建项目

Abstract:

Objective To establish and evaluate the performance and clinical application of plasma cfDNA determination in colorectal cancer patients based on next generation sequencing（NGS） platform. Methods Plasma circulating free DNA（cfDNA） determination system（cfDNA panel） for colorectal cancer patients had been established. The accuracy,precision,minimum sample amount and input of extraction,sensitivity and specificity of cfDNA panel were evaluated. The results were compared with both the results of Miseq Dx NGS platform and amplification refractory mutation system（ARMS）. Results The accuracy of cfDNA panel for colorectal cancer was 99.97%,and the determination rate of expected mutation was 100%. The minimum amount of plasma extraction was 1 mL,and the minimum amount of cfDNA input was 10 ng.The sensitivity was 0.2%. The 10 000 mg/L hemoglobin,500 mg/L bilirubin or 2% fat emulsion had no effet on the extraction of colorectal cancer cfDNA panel. Compared with the results of Miseq Dx NGS platform and ARMS,the consistency rates were 94.12% and 90.91%,respectively,and the positive and negative predictive rates of KRAS,NRAS,BRAF and PIK3CA were 100% and 99.60%,respectively. Conclusions The performance of cfDNA panel in colorectal cancer meets the needs of clinical application. The results of plasma cfDNA determination are highly consistent with the determination results of matched tumor tissue,which is a useful supplement for tissue biopsy.

Key words: Circulating free DNA, Colorectal cancer, Next generation sequencing, Laboratory developed test

中图分类号:

R197.323.2

朱赟洁, 马峥尧, 沈敏娜, 周琰, 黄斐, 陈馨宁, 张春燕, 王蓓丽, 郭玮. 结直肠癌患者血浆cfDNA检测方法的建立及临床应用评估[J]. 检验医学, 2022, 37(6): 561-567.

ZHU Yunjie, MA Zhengyao, SHEN Minna, ZHOU Yan, HUANG Fei, CHEN Xinning, ZHANG Chunyan, WANG Beili, GUO Wei. Establishment and clinical application evaluation of plasma cfDNA determination in colorectal cancer patients[J]. Laboratory Medicine, 2022, 37(6): 561-567.

图/表 5

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实测结果	预期结果		合计
实测结果	阳性	阴性	合计
阳性	219	0	219
阴性	3	9 216	9 219
合计	222	9 216	9 438

实测结果	预期结果		合计
实测结果	阳性	阴性	合计
阳性	219	0	219
阴性	3	9 216	9 219
合计	222	9 216	9 438

基因	x	M	s	CV/%
PIK3CA E545K	1.34	1.27	0.31	23.13
KRAS G13D	2.43	2.54	0.35	14.40
TP53 S241F	1.36	1.32	0.29	21.32
BRAF V600E	1.20	1.23	0.27	22.50
TP53 R273H	4.71	4.81	0.76	16.14
PIK3CA H1047R	1.17	1.21	0.33	28.21

基因	x	M	s	CV/%
PIK3CA E545K	1.34	1.27	0.31	23.13
KRAS G13D	2.43	2.54	0.35	14.40
TP53 S241F	1.36	1.32	0.29	21.32
BRAF V600E	1.20	1.23	0.27	22.50
TP53 R273H	4.71	4.81	0.76	16.14
PIK3CA H1047R	1.17	1.21	0.33	28.21

编号	处理方案	样本量/mL	理论结果	实测结果
1	野生型血浆-1	4	野生型	野生型
2	突变型血浆-1	4	BRAF V600E	BRAF p.V600E
3	野生型血浆-2	4	野生型	野生型
4	突变型血浆-2	4	BRAF K601E	BRAF p.K601E
5	胆红素+野生型血浆-1	4	野生型	野生型
6	胆红素+突变型血浆-1	4	BRAF V600E	BRAF V600E
7	脂肪乳+野生型血浆-2	4	野生型	野生型
8	脂肪乳+突变型血浆-2	4	BRAF K601E	BRAF K601E

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Establishment and clinical application evaluation of plasma cfDNA determination in colorectal cancer patients

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