串联质谱技术在X- 连锁肾上腺脑白质营养不良病筛查中的应用价值

doi:10.3969/j.issn.1673-8640.2019.12.001

摘要/Abstract

摘要：

目的建立串联质谱（MS/MS）检测极长链酰基肉碱（VLCAC）和溶血磷脂酰胆碱（LPC）的方法,初步探讨VLCAC和LPC对X-连锁肾上腺脑白质营养不良病（X-ALD）的诊断价值。方法选取被明确诊断为X-ALD的患儿10例和行遗传代谢性疾病筛查的正常新生儿3 530名。收集所有对象的滤纸干血片样本,使用含稳定同位素内标[²H₃-二十六碳酰基肉碱（²H₃-C26）和²H₄-二十六碳溶血磷脂酰胆碱（²H₄-C26：0-LPC）]的溶剂萃取滤纸干血片样本中的VLCAC和LPC（非衍生化法）,直接采用MS/MS检测二十碳酰基肉碱（C20）、二十二碳酰基肉碱（C22）、二十四碳酰基肉碱（C24）、二十六碳酰基肉碱（C26）、二十碳溶血磷脂酰胆碱（C20：0-LPC）、二十二碳溶血磷脂酰胆碱（C22：0-LPC）、二十四碳溶血磷脂酰胆碱（C24：0-LPC）和二十六碳溶血磷脂酰胆碱（C26：0-LPC）。对建立的MS/MS方法进行方法学评价（精密度、准确度、线性）。采用偏最小二乘法分析各项指标对疾病的贡献度。采用受试者工作特征（ROC）曲线评估各项指标诊断X-ALD的效能。结果低水平C26和C26：0-LPC的批内变异系数（CV）分别为4.16%和7.75%,批间CV分别为8.29%和9.17%;高水平C26和C26：0-LPC的批内CV分别为5.57%和8.68%,批间CV分别为7.45%和8.11%。准确度为93.25%~104.94%。C26和C26：0-LPC实测值与预测值之间的决定系数（r²）分别为0.996和0.994。除C20、C24：0-LPC/C20：0-LPC、C24：0-LPC/C22：0-LPC 、C26：0-LPC/C20：0-LPC外,其他指标正常对照组与X-ALD组差异均有统计学意义（P<0.05）。C26、C26/C22比值和C26：0-LPC对疾病的贡献度最高（偏回归系数分别为0.175 3、0.130 0和0.079 2）。ROC曲线分析结果显示,C26和C26/C22比值诊断X-ALD的敏感性均为100%,特异性均为100%,曲线下面积（AUC）均为1.0;C26：0-LPC诊断X-ALD的敏感性为100%,特异性为72.9%,AUC为0.972。结论非衍生化MS/MS检测VLCAC和LPC有较高的精密度和准确度,C26或可作为诊断X-ALD的生物标志物。

关键词: 极长链酰基肉碱, 溶血磷脂酰胆碱, 串联质谱, X-连锁肾上腺脑白质营养不良病

Abstract:

Objective To establish a tandem mass spectrometry（MS/MS） for the determinations of very long chain acylcarnitine（VLCAC） and lysophosphatidylcholine（LPC）,and to evaluate the diagnostic efficiency of VLCAC and LPC in the diagnosis of X-linked adrenoleukodystrophy（X-ALD）. Methods A total of 3 530 samples of dried blood spots for screening genetic metabolic diseases and 10 samples of dried blood spots from children with X-ALD were collected. VLCAC and LPC were extracted from dried blood spots by solvent extraction with standard substances containing stable isotopic markers of ²H₃-hexacosanoylcarnitine（²H₃-C26） and ²H₄-C26：0 lysophosphatidylcholine（²H₄-C26：0-LPC） direct injection in tandem mass spectrometer. Eicosanoylcarnitine（C20）, docosanoylcarnitine（C22）, tetracosanoylcarnitine（C24）, hexacosanoylcarnitine（C26）, C20：0 lysophosphatidylcholine（C20：0-LPC）, C22：0 lysophosphatidylcholine（C22：0-LPC）, C24：0 lysophosphatidylcholine（C24：0-LPC） and C26：0 lysophosphatidylcholine（C26：0-LPC） were detected. Methodological evaluation （precision,accuracy and linearity） of the established MS/MS was performed. Partial least square method was used to analyze the contribution of each index to disease. Receiver operating characteristic（ROC）curve was used to evaluate the efficiency of each index for the diagnosis of X-ALD. Results The within-run coefficients of variation（CV） of low-concentration C26 and C26：0-LPC were 4.16% and 7.75%,and the between-run CV were 8.29% and 9.17%,respectively. The within-run CV of high-concentration C26 and C26：0-LPC were 5.57% and 8.68%,and the between-run CV were 7.45% and 8.11%,respectively. The accuracies were 93.25%-104.94%. The determination coefficients（r²） between the measured values of different dilution concentrations and the theoretical concentration were 0.996 and 0.994. Except for C20,C24：0-LPC/C20：0-LPC,C24：0-LPC/C22：0-LPC and C26：0-LPC/C20：0-LPC,the difference between control group and X-ALD group was statistically significant（P<0.05）. C26,C26/C22 ratio and C26：0-LPC had the highest contribution to disease（the partial regression coefficients were 0.175 3,0.130 0 and 0.079 2,respectively）. ROC curve analysis showed that the sensitivity and specificity of the ratios of C26 and C26/C22 in diagnosing X-ALD were all 100%,and the area under curve（AUC） was 1.0. The sensitivity,specificity and AUC of C26：0-LPC were 100%,72.9% and 0.972,respectively. Conclusions Non-derivatized MS/MS has high precision and accuracy in detecting VLCAC and LPC. C26 may be a diagnostic marker of X-ALD.

Key words: Very long chain acylcarnitine, Lysophosphatidylcholine, Tandem mass spectrometry, X-linked adrenoleukodystrophy

中图分类号:

R446.1

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图/表 7

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项目	参考值（μmol/L）	准确度		精密度（CV）		线性方程	r²值
项目	参考值（μmol/L）	批内（%）	批间（%）	批内（%）	批间（%）	线性方程	r²值
C26						Y=2.24X-0.03	0.996
低水平	0.73	96.23	93.25	4.16	8.29
高水平	1.77	104.94	102.38	5.57	7.45
C26：0-LPC						Y=3.02X+0.15	0.994
低水平	0.95	96.58	95.71	7.75	9.17
高水平	3.26	98.82	101.22	8.68	8.11

项目	参考值（μmol/L）	准确度		精密度（CV）		线性方程	r²值
项目	参考值（μmol/L）	批内（%）	批间（%）	批内（%）	批间（%）	线性方程	r²值
C26						Y=2.24X-0.03	0.996
低水平	0.73	96.23	93.25	4.16	8.29
高水平	1.77	104.94	102.38	5.57	7.45
C26：0-LPC						Y=3.02X+0.15	0.994
低水平	0.95	96.58	95.71	7.75	9.17
高水平	3.26	98.82	101.22	8.68	8.11

组别	例数	C20（μmol/L）	C22（μmol/L）	C24（μmol/L）	C26（μmol/L）
X-ALD组	10	0.02（0.01~0.02）	0.01（0.01~0.01）	0.10（0.07~0.12）	0.12（0.09~0.15）
正常对照组	3 550	0.01（0.01~0.02）	0.01（0.00~0.01）	0.02（0.02~0.03）	0.01（0.009-0.010）
U值		2.401 5	2.892 9	5.783 8	8.697 4
P值		0.016 1	0.003 8	<0.000 1	<0.000 1
组别		C20：0-LPC（μmol/L）	C22：0-LPC（μmol/L）	C24：0-LPC（μmol/L）	C26：0-LPC（μmol/L）
X-ALD组		0.32（0.27~0.57）	0.245（0.19~0.31）	0.72（0.59~0.93）	0.68（0.41~0.88）
正常对照组		0.18（0.14~0.23）	0.14（0.12~0.18）	0.38（0.32~0.45）	0.20（0.17~0.24）
U值		3.849 6	3.680 9	4.696 3	5.168 4
P值		0.000 1	0.000 2	<0.000 1	<0.000 1
组别		C24/C20比值	C24/C22比值	C26/C20比值	C26/C22比值
X-ALD组		5.25（4.54~7.75）	8.50（7.45~10.01）	7.08（6.578~8.63）	10.00（9.03~12.11）
正常对照组		2.00（1.02~2.09）	2.00（1.78~3.01）	1.00（0.50~1.03）	1.00（0.91~1.16）
U值		5.610 4	5.801 7	6.391 4	7.966 7
P值		<0.000 1	<0.000 1	<0.000 1	<0.000 1
组别		C24：0-LPC/C20：0-LPC比值	C24：0-LPC/C22：0-LPC比值	C26：0-LPC/C20：0-LPC比值	C26：0-LPC/C22：0-LPC比值
X-ALD组		2.12（1.49~2.67）	3.13（2.32~3.98）	1.50（0.96~2.56）	2.50（1.79~3.55）
正常对照组		2.05（1.64~2.57）	2.64（2.19~3.13）	1.10（0.85~1.43）	1.41（1.13~1.73）
U值		-0.033 4	1.432 7	1.776 6	3.037 6
P值		0.973 2	0.151 9	0.075 6	0.002 4

组别	例数	C20（μmol/L）	C22（μmol/L）	C24（μmol/L）	C26（μmol/L）
X-ALD组	10	0.02（0.01~0.02）	0.01（0.01~0.01）	0.10（0.07~0.12）	0.12（0.09~0.15）
正常对照组	3 550	0.01（0.01~0.02）	0.01（0.00~0.01）	0.02（0.02~0.03）	0.01（0.009-0.010）
U值		2.401 5	2.892 9	5.783 8	8.697 4
P值		0.016 1	0.003 8	<0.000 1	<0.000 1
组别		C20：0-LPC（μmol/L）	C22：0-LPC（μmol/L）	C24：0-LPC（μmol/L）	C26：0-LPC（μmol/L）
X-ALD组		0.32（0.27~0.57）	0.245（0.19~0.31）	0.72（0.59~0.93）	0.68（0.41~0.88）
正常对照组		0.18（0.14~0.23）	0.14（0.12~0.18）	0.38（0.32~0.45）	0.20（0.17~0.24）
U值		3.849 6	3.680 9	4.696 3	5.168 4
P值		0.000 1	0.000 2	<0.000 1	<0.000 1
组别		C24/C20比值	C24/C22比值	C26/C20比值	C26/C22比值
X-ALD组		5.25（4.54~7.75）	8.50（7.45~10.01）	7.08（6.578~8.63）	10.00（9.03~12.11）
正常对照组		2.00（1.02~2.09）	2.00（1.78~3.01）	1.00（0.50~1.03）	1.00（0.91~1.16）
U值		5.610 4	5.801 7	6.391 4	7.966 7
P值		<0.000 1	<0.000 1	<0.000 1	<0.000 1
组别		C24：0-LPC/C20：0-LPC比值	C24：0-LPC/C22：0-LPC比值	C26：0-LPC/C20：0-LPC比值	C26：0-LPC/C22：0-LPC比值
X-ALD组		2.12（1.49~2.67）	3.13（2.32~3.98）	1.50（0.96~2.56）	2.50（1.79~3.55）
正常对照组		2.05（1.64~2.57）	2.64（2.19~3.13）	1.10（0.85~1.43）	1.41（1.13~1.73）
U值		-0.033 4	1.432 7	1.776 6	3.037 6
P值		0.973 2	0.151 9	0.075 6	0.002 4

变量	项目	偏回归系数
截距		-0.103 8
X1	C22	0.072 3
X2	C24	0.026 5
X3	C26	0.175 3
X4	C20：0-LPC	0.043 1
X5	C22：0-LPC	0.023 4
X6	C24：0-LPC	0.022 9
X7	C26：0-LPC	0.079 2
X8	C24/C20比值	0.000 7
X9	C24/C22比值	-0.029 2
X10	C26/C20比值	-0.006 2
X11	C26/C22比值	0.130 0
X12	C26：0-LPC/C22：0-LPC比值	0.012 5