重组人胱抑素C质控品的制备及其性能分析

doi:10.3969/j.issn.1673-8640.2017.08.017

摘要/Abstract

摘要：

目的以大肠埃希菌BL21表达的重组人胱抑素C（Cys C）蛋白作为原材料制备Cys C质控品,并对制备的质控品的各项性能进行分析。方法通过基因工程手段,利用表达载体pCold1及宿主大肠埃希菌BL21表达重组人Cys C蛋白,纯化后对其进行冷冻干燥。结果成功表达出重组人Cys C蛋白包涵体,透析复性后得到具有免疫学活性的可溶性Cys C重组蛋白。利用原核表达的Cys C蛋白制备Cys C质控品,并经过HITACHI及Roche平台进行检测,Cys C质控品在这2个平台都适用。结论利用重组人Cys C蛋白制备的Cys C质控品具有良好的稳定性及可靠性,可以作为质控品用于不同的体外检测平台。

关键词: 胱抑素C, 重组蛋白, 质控品, 稳定性

Abstract:

Objective To prepare cystatin C（Cys C） quality control material by using recombinant human Cys C protein expressed in Escherichia coli BL21 as basic material. Methods By gene engineering method,recombinant human Cys C protein was expressed through pCold1 and BL21. Freeze drying was performed after purification. Results Inclusion bodies of recombinant human Cys C protein was expressed successfully. After renaturation by dialysis method,soluble recombinant human Cys C protein with immunological activity had been prepared. Cys C quality control material was prepared by using the recombinant human Cys C protein and determined by HITACHI and ROCHE analysis systems. Cys C quality control was suitable for the 2 analysis systems. Conclusions Cys C quality control material prepared by recombinant human Cys C protein has good stability and reliability,it could be used in various analysis platforms of in vitro diagnosis.

Key words: Cystatin C, Recombinant protein, Quality control material, Stability

中图分类号:

R446.1

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图/表 6

图1 重组人Cys C原核表达载体的构建、表达及纯化结果注：（a）重组表达载体pCold1-cys c（nsp）经过BamH I和HindⅢ酶切后的琼脂糖凝胶电泳结果;1为PCold1-cys c（nsp）的BamH I和HindⅢ酶切结果,M为DNA Marker。（b）重组人Cys C（带有His标签,相对分子质量为16 000）经过纯化、复性后的SDS-PAGE分析结果;1和2为不同批次、纯化后的重组人Cys C蛋白,M为蛋白质Marker。（c）纯化后的重组人Cys C的Western blotting检测结果;1为BL21菌体总蛋白（空白对照）,2为经过纯化的重组人Cys C蛋白,M为蛋白质Marker

图2 重组人Cys C复性后的ELISA结果注：捕获抗体为鼠抗,二抗为标记有辣根过氧化物酶的羊抗鼠的检测抗体

表1 4批重组人Cys C质控品在HITACHI和Roche平台上的精密度检测结果

项目	第1批			第2批			第3批			第4批
项目	L1	L2	L3	L1	L2	L3	L1	L2	L3	L1	L2	L3
$x ?$ （mg/L）	0.72	2.27	6.27	0.66	2.23	6.82	0.63	2.25	6.53	0.77	2.68	6.88
CV（%）	3	1	2	4	3	4	3	2	3	2	1	2
s₁	0.026	0.035	0.099	0.026	0.077	0.292	0.028	0.040	0.185	0.022	0.034	0.134
s₂	0.008	0.011	0.029	0.009	0.022	0.019	0.016	0.019	0.030	0.013	0.023	0.040
上限（mg/L）	0.83	2.61	6.90	0.76	2.56	7.50	0.72	2.59	7.18	0.89	3.08	7.57
下限（mg/L）	0.61	1.93	6.21	0.56	1.90	6.75	0.54	1.91	6.46	0.65	2.28	6.19

表1 4批重组人Cys C质控品在HITACHI和Roche平台上的精密度检测结果

项目	第1批			第2批			第3批			第4批
项目	L1	L2	L3	L1	L2	L3	L1	L2	L3	L1	L2	L3
$x ?$ （mg/L）	0.72	2.27	6.27	0.66	2.23	6.82	0.63	2.25	6.53	0.77	2.68	6.88
CV（%）	3	1	2	4	3	4	3	2	3	2	1	2
s₁	0.026	0.035	0.099	0.026	0.077	0.292	0.028	0.040	0.185	0.022	0.034	0.134
s₂	0.008	0.011	0.029	0.009	0.022	0.019	0.016	0.019	0.030	0.013	0.023	0.040
上限（mg/L）	0.83	2.61	6.90	0.76	2.56	7.50	0.72	2.59	7.18	0.89	3.08	7.57
下限（mg/L）	0.61	1.93	6.21	0.56	1.90	6.75	0.54	1.91	6.46	0.65	2.28	6.19

表2 朗道Cys C质控品在HITACHI和Roche平台上的精密度检测结果

项目	第1批		第2批		第3批		第4批
项目	CYS5019	CYS5020	CYS5019	CYS5020	CYS5019	CYS5020	CYS5019	CYS5020
$x ?$ （mg/L）	0.71	3.19	0.59	3.41	0.65	3.38	0.62	3.27
s₁	0.022	0.017	0.025	0.027	0.021	0.031	0.019	0.016
s₂	0.011	0.012	0.008	0.008	0.019	0.021	0.008	0.008
CV（%）	3	0	4	1	1	1	3	0
上限（mg/L）	0.82	3.51	0.68	3.75	0.75	3.72	0.71	3.60
下限（mg/L）	0.60	2.87	0.50	3.07	0.55	3.04	0.53	2.94

表2 朗道Cys C质控品在HITACHI和Roche平台上的精密度检测结果

项目	第1批		第2批		第3批		第4批
项目	CYS5019	CYS5020	CYS5019	CYS5020	CYS5019	CYS5020	CYS5019	CYS5020
$x ?$ （mg/L）	0.71	3.19	0.59	3.41	0.65	3.38	0.62	3.27
s₁	0.022	0.017	0.025	0.027	0.021	0.031	0.019	0.016
s₂	0.011	0.012	0.008	0.008	0.019	0.021	0.008	0.008
CV（%）	3	0	4	1	1	1	3	0
上限（mg/L）	0.82	3.51	0.68	3.75	0.75	3.72	0.71	3.60
下限（mg/L）	0.60	2.87	0.50	3.07	0.55	3.04	0.53	2.94

表3 重组人Cys C质控品4 ℃和25 ℃复溶（开瓶）稳定性检测结果

测试温度	测试天数（d）	低值（mg/L）	中值（mg/L）	高值（mg/L）
4 ℃	1	0.67	2.49	6.37
	2	0.70	2.41	6.34
	4	0.73	2.48	6.25
	8	0. 72	2.49	6.49
25 ℃	1	0.72	2.54	6.37
	2	0.72	2.60	6.35
	4	0.77	2.60	6.23
	8	0.76	2.65	6.86

表4 重组人Cys C质控品37 ℃稳定性检测结果

测试天数（d）	低值（mg/L）	中值（mg/L）	高值（mg/L）
3	0.77	2.65	6.46
6	0.85	2.52	6.34
9	0.78	2.58	6.27
12	0.76	2.48	5.86

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