超高效液相色谱串联质谱同时检测人血清5种甾体激素方法学及生物参考区间的建立

doi:10.3969/j.issn.1673-8640.2022.02.015

检验医学 ›› 2022, Vol. 37 ›› Issue (2): 165-173.DOI: 10.3969/j.issn.1673-8640.2022.02.015

超高效液相色谱串联质谱同时检测人血清5种甾体激素方法学及生物参考区间的建立

陆优丽, 杨双双, 张美微, 欧美贤, 董春霞, 沈薇薇, 姜凤丽, 李水军()

上海药物Ⅰ期临床暨药物一致性评价工程技术研究中心上海市临床质谱研究所上海市徐汇区中心医院复旦大学附属中山医院徐汇医院,上海 200031

收稿日期:2021-07-02 修回日期:2021-08-29 出版日期:2022-02-28 发布日期:2022-03-15
通讯作者: 李水军
作者简介:李水军,E-mail: sjli@scrc.ac.cn。
陆优丽,女,1983年生,博士,副主任药师,主要从事质谱临床检验相关工作;
杨双双,女,1995年生,硕士,药师,主要从事质谱临床检验相关工作。第一联系人：陆优丽和杨双双对本研究具有同等贡献,并列为第一作者。
基金资助:
上海市徐汇区中心医院课题资助项目(2017XHYY-10)

Simultaneous determination of 5 steroid hormones in human serum by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and establishment of reference intervals in healthy adults

LU Youli, YANG Shuangshuang, ZHANG Meiwei, OU Meixian, DONG Chunxia, SHEN Weiwei, JIANG Fengli, LI Shuijun()

Shanghai Engineering Research Center of Phase Ⅰ Clinical Research and Quality Consistency Evaluation for Drugs,Shanghai Institute of Clinical Mass Spectrometry,Shanghai Xuhui Central Hospital,Zhongshan-Xuhui Hospital Affiliated to Fudan University,Shanghai 200031,China

Received:2021-07-02 Revised:2021-08-29 Online:2022-02-28 Published:2022-03-15
Contact: LI Shuijun

摘要/Abstract

摘要：

目的建立超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）同时测定人血清中睾酮（T）、双氢睾酮（DHT）、雄烯二酮（AD）、脱氢表雄酮（DHEA）和17α羟孕酮（17OHP）的方法,并确定表观健康人群血清中5种甾体激素的参考区间。方法血清样品沉淀后经SOLAμ HRP固相萃取柱纯化,采用Poroshell 120 EC-C18色谱柱分离,用含0.05%甲酸的30%乙腈溶液和90%乙腈溶液梯度洗脱。采用电喷雾正离子多反应监测模式检测,采用同位素内标法定量检测甾体激素的浓度。对建立的UPLC-MS/MS方法进行全面的性能验证,并建立适用于上海地区人群人血清5种甾体激素的参考区间。结果 UPLC-MS/MS检测人血清中5种甾体激素的最低定量限为0.01~0.10 ng/mL,标准曲线范围覆盖1 000倍,r²值均>0.999 5,线性良好,样本经稀释后可报告范围覆盖5 000倍。5种分析物批内与批间的准确度为95.0%~105.6%,精密度均<8%。8种结构类似物对目标分析物均无干扰,高三酰甘油不影响检测结果,溶血可导致DHEA检测值降低。各分析物的提取回收率为60.5%~93.3%,内标校正后无明显的基质效应。血清样品室温放置4 h、-25~-15 ℃放置30 d、-90~-70 ℃放置100 d,甾体激素均可被稳定测量。T和17OHP项目参加2019年国家卫生健康委临床检验中心全国内分泌正确度验证质谱法调查,UPLC-MS/MS检测结果与靶值的偏差为-5.00%~0.38%。用UPLC-MS/MS检测367名体检者血清,结果显示,男性与女性之间5种甾体激素浓度差异均有统计学意义（P<0.05）,将女性体检者分为16~50岁（123名）和>50岁（124名）2个年龄亚组,2个亚组之间差异有统计学意义（P<0.05）。结论建立并验证了一种可同时检测人血清中5种甾体激素的UPLC-MS/MS方法,该方法适用于上海市徐汇区中心医院中心实验室的参考区间。

关键词: 超高效液相色谱, 质谱, 甾体激素, 血清, 参考区间

Abstract:

Objective To establish and validate a method for the simultaneous determination of testosterone（T）,dihydrotestosterone（DHT）,androstenedione（AD）,dehydroepiandrosterone（DHEA） and 17alpha-hydroxyprogesterone（17OHP） in human serum by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）,and to establish the reference intervals of 5 steroid hormones in healthy adults. Methods The serum samples were purified by SOLAμ HRP solid-phase extraction,and they were separated by Poroshell 120 EC-C18 analytical column. Mobile phase was constituted of 30% acetonitrile solution and 90% acetonitrile solution containing 0.05% formic acid with gradient elution. The electrospray positive ion multi-reaction monitoring mode was used for determination,and the isotope internal standard method was used to quantify the concentration of steroid hormones. The performance of the method was verified comprehensively,and the reference intervals suitable for the local population in Shanghai were established. Results The minimum limits of quantification of the 5 steroid hormones in human serum were 0.01-0.10 ng/mL. The standard curve range covered 1 000 times （r²≥0.999 5） and showed good linearity,and the sample after dilution can be reported to cover the range of 5 000 times. The average accuracy of 5 steroid hormones ranged from 95.0% to 105.6%,with the precision of <8%. None of the 8 structural analogs interfered with the target analytes,high triglyceride blood did not affect the determination results,and hemolysis resulted in low DHEA concentration. The extraction recoveries of the analytes were 60.5%-93.3%,and there was no obvious matrix effect after calibration of internal standard. Analytes demonstrated good stability at room temperature for 4 h,at -25--15 ℃ for 30 d or at -90--70 ℃ for 100 d. The method was used and participated in a survey of endocrine accuracy verification supplied by the National Center for Clinical Laboratories in 2019. The determination deviations of T and 17OHP were -5.00%-0.38%. The results of 367 physical examination subjects were analyzed and showed that there was statistical significance in the concentration of 5 steroid hormones between females and males（P<0.05）. There was statistical significance between the 2 age subgroups（aged 16-50 years and aged>50 years） of female groups（P<0.05）. Conclusions A UPLC-MS/MS has been established for the determination of 5 steroid hormones in human serum,and the reference intervals suitable for the Central Laboratory of Shanghai Xuhui Central Hospital have been verified.

Key words: Ultra-performance liquid chromatography, Mass spectrometry, Steroid hormone, Human serum, Reference interval

中图分类号:

R446.1

陆优丽, 杨双双, 张美微, 欧美贤, 董春霞, 沈薇薇, 姜凤丽, 李水军. 超高效液相色谱串联质谱同时检测人血清5种甾体激素方法学及生物参考区间的建立[J]. 检验医学, 2022, 37(2): 165-173.

LU Youli, YANG Shuangshuang, ZHANG Meiwei, OU Meixian, DONG Chunxia, SHEN Weiwei, JIANG Fengli, LI Shuijun. Simultaneous determination of 5 steroid hormones in human serum by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and establishment of reference intervals in healthy adults[J]. Laboratory Medicine, 2022, 37(2): 165-173.

图/表 9

参考文献 18

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分析物	标准曲线添加液						质控添加液
分析物	S1	S2	S3	S4	S5	S6	低浓度	中浓度	高浓度
T、AD、17OHP	1	2	10	50	250	1 000	3	25	800
DHT	2	4	20	100	500	2 000	6	50	1 600
DHEA	10	20	100	500	2 500	10 000	30	250	8 000

分析物	标准曲线添加液						质控添加液
分析物	S1	S2	S3	S4	S5	S6	低浓度	中浓度	高浓度
T、AD、17OHP	1	2	10	50	250	1 000	3	25	800
DHT	2	4	20	100	500	2 000	6	50	1 600
DHEA	10	20	100	500	2 500	10 000	30	250	8 000

分析物名称	监测离子对/（m/z）	碰撞能量/eV	监测方式	内标
T	289.2^①/97.0^②/109.0^③	31/35	+	T-d₃
DHT	291.2^①/255.2^②/159.0^③	21/31	+	DHT-d₃
AD	287.2^①/97.0^②/109.0^③	30/33	+	AD-¹³C₃
DHEA	289.2^①/253.2^②/213.1^③	16/26	+	DHEA-d₅
17OHP	331.2^①/97.0^②/109.0^③	33/33	+	17OHP-d₈
T-d₃	292.2^①/97.0^②	31	+	无
DHT-d₃	294.2^①/258.2^②	21	+	无
AD-¹³C₃	290.2^①/100.0^②	30	+	无
DHEA-d₅	294.3^①/258.2^②	16	+	无
17OHP-d₈	339.2^①/100.0^②	33	+	无

分析物名称	监测离子对/（m/z）	碰撞能量/eV	监测方式	内标
T	289.2^①/97.0^②/109.0^③	31/35	+	T-d₃
DHT	291.2^①/255.2^②/159.0^③	21/31	+	DHT-d₃
AD	287.2^①/97.0^②/109.0^③	30/33	+	AD-¹³C₃
DHEA	289.2^①/253.2^②/213.1^③	16/26	+	DHEA-d₅
17OHP	331.2^①/97.0^②/109.0^③	33/33	+	17OHP-d₈
T-d₃	292.2^①/97.0^②	31	+	无
DHT-d₃	294.2^①/258.2^②	21	+	无
AD-¹³C₃	290.2^①/100.0^②	30	+	无
DHEA-d₅	294.3^①/258.2^②	16	+	无
17OHP-d₈	339.2^①/100.0^②	33	+	无

添加浓度/（ng/mL）	批内		批间
添加浓度/（ng/mL）	精密度（CV）/%	准确度/%	精密度（CV）/%	准确度/%
T
0.03	3.43	102.8	2.91	100.9
0.25	4.12	101.1	3.64	100.7
8.00	2.30	97.4	3.01	97.1
DHT
0.06	2.92	101.9	3.56	100.5
0.50	3.22	104.8	3.49	105.2
16.00	2.53	100.4	2.87	102.4
AD
0.03	2.62	99.2	4.47	99.6
0.25	3.54	99.8	3.57	101.4
8.00	2.59	104.2	2.97	102.3
DHEA
0.30	4.75	101.8	4.75	98.2
2.50	3.08	101.7	5.33	101.8
80.00	3.74	100.5	5.66	102.6
17OHP
0.03	2.83	96.9	4.68	95.0
0.25	3.51	95.2	4.80	96.3
8.00	2.85	99.1	4.35	101.2

超高效液相色谱串联质谱同时检测人血清5种甾体激素方法学及生物参考区间的建立

Simultaneous determination of 5 steroid hormones in human serum by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and establishment of reference intervals in healthy adults

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项目	分析物基质效应	内标校正的基质效应	分析物提取回收率/%	内标提取回收率/%
T	0.669 2	0.945 3	60.5	63.5
DHT	0.827 5	1.005 0	84.9	84.0
AD	0.724 4	1.003 0	79.3	77.9
DHEA	0.820 3	0.966 9	83.9	83.2
17OHP	0.768 4	1.009 0	93.3	94.1

项目	25 ℃		-25~-15 ℃		-90~-70 ℃
项目	4 h	24 h	30 d	100 d	30 d	100 d
T	0.76	-2.81	8.89	0.57	8.75	0.68
DHT	0.47	-6.48	-3.15	-4.61	-1.76	1.40
AD	0.34	-3.70	4.25	3.76	1.82	2.98
DHEA	-10.91	-37.33	-2.87	-14.47	-0.96	-11.68
17OHP	-2.81	0.87	8.80	3.75	4.03	1.21

项目	平均值/（nmol/L)	靶值/（nmol/L）	偏移/%	评价范围/（nmol/L）	2s	CV/%	评价结果
T
201911	5.4	5.6	-3.05	4.9~6.3	0.4	3.7	通过
201912	23.9	23.8	0.38	20.8~26.8	1.8	3.8	通过
17OHP
201911	7.6	8.0	-5.00	7.0~9.0	0.6	3.9	通过
201912	29.6	30.6	-3.30	26.8~34.4	1.2	2.0	通过

组别	例数	T/（ng/mL）	DHT/（ng/mL）	DHEA/（ng/mL）	AD/（ng/mL）	17OHP/（ng/mL）
男性	120	4.78（3.93~5.84）	0.30（0.22~0.36）	3.50（2.44~5.30）	0.89（0.70~1.11）	0.99（0.78~1.23）
16~20岁	20	4.49（3.75~6.13）	0.25（0.19~0.33）	3.29（2.33~5.68）	0.90（0.67~1.14）	1.08（0.79~1.60）
21~30岁	20	5.38（4.34~6.75）	0.26（0.24~0.41）	5.72（4.45~6.75）	0.99（0.85~1.26）	1.01（0.86~1.42）
31~40岁	20	4.50（0.86~1.42）	0.30（0.23~0.37）	3.68（2.41~5.30）	0.89（0.70~1.23）	0.83（0.62~1.24）
41~50岁	20	4.84（3.77~5.67）	0.30（0.21~0.42）	3.50（2.72~4.20）	0.72（0.65~1.02）	0.86（0.72~1.20）
51~60岁	20	4.78（3.88~5.84）	0.31（0.26~0.41）	3.30（2.58~4.71）	0.93（0.71~1.50）	1.00（0.84~1.05）
>61岁	20	4.47（3.93~5.69）	0.21（0.13~0.36）	1.73（1.26~2.77）	0.76（0.64~0.95）	0.93（0.78~1.28）
女性	247	0.20（0.12~0.28）^*	0.03（0.01~0.06）*	3.00（1.36~5.68）	0.74（0.45~1.20）*	0.35（0.20~0.75）*
16~20岁	20	0.27（0.22~0.32）^*#△	0.06（0.04~0.09）^*#△	5.82（4.06~7.76）^*#△	1.11（0.97~1.36）^*#△	0.50（0.33~1.00）^*#△
21~30岁	37	0.33（0.24~0.41）^*#△	0.07（0.05~0.10）^*#△	6.68（4.84~9.25）^*#△	1.38（1.27~1.81）^*#△	0.58（0.37~1.67）^*#△
31~40岁	33	0.26（0.22~0.34）^*#△	0.05（0.03~0.08）^*#△	5.24（3.25~7.81）^*#△	1.22（0.94~1.43）^*#△	0.56（0.30~1.55）^*#△
41~50岁	33	0.20（0.16~0.28）^*#△	0.04（0.00~0.06）^*#△	3.60（2.78~5.42）^*#△	0.89（0.74~1.13）^*#△	0.62（0.26~1.24）^*#△
51~60岁	28	0.12（0.10~0.17）^*△	0.01（0.00~0.04）^*△	2.59（1.48~3.70）^*△	0.48（0.38~0.62）^*△	0.20（0.14~0.37）^*△
>61岁	96	0.13（0.08~0.21）^*	0.01（0.00~0.03）^*	1.24（0.56~2.21）^*	0.44（0.32~0.62）^*	0.24（0.12~0.40）^*

人群	例数	T/（ng/mL）	DHT/（ng/mL）	DHEA/（ng/mL）	AD/（ng/mL）	17OHP/（ng/mL）
≥16岁男性	120	2.77~9.29	0.088~0.670	0.99~10.92	0.40~1.66	0.440~1.880
16~50岁女性	123	0.10~0.59	0.000~0.130	1.24~15.01	0.47~2.51	0.160~2.680
>50岁女性	124	0.04~0.37	0.000~0.086	0.00~5.89	0.13~0.96	0.029~0.850

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