LAMP技术检测非小细胞肺癌患者外周血EGFR基因L858R位点突变方法的建立及应用

doi:10.3969/j.issn.1673-8640.2020.03.018

检验医学 ›› 2020, Vol. 35 ›› Issue (3): 273-277.DOI: 10.3969/j.issn.1673-8640.2020.03.018

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LAMP技术检测非小细胞肺癌患者外周血EGFR基因L858R位点突变方法的建立及应用

钮静¹, 权文强², 李冬²()

1.上海市宝山区中西医结合医院检验科,上海 210900
2.同济大学附属同济医院检验科,上海 200065

收稿日期:2018-08-19 出版日期:2020-03-30 发布日期:2020-04-17
通讯作者: 李冬
作者简介:通信作者：李冬,E-mail：186ld@163.com。
作者简介：钮静,女,1984年生,学士,主管技师,主要从事临床检验工作。
基金资助:
上海市第四轮公共卫生体系建设三年行动计划（15GWZK0301）

Establishment and application of loop-mediated isothermal amplification for EGFR gene L858R mutation determination in non-small cell lung cancer patients

NIU Jing¹, QUAN Wenqiang², LI Dong²()

1. Department of Clinical Laboratory,Shanghai Baoshan Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Shanghai 210900,China
2. Department of Clinical Laboratory,Tongji Hospital,Tongji University,Shanghai 200065,China

Received:2018-08-19 Online:2020-03-30 Published:2020-04-17
Contact: LI Dong

摘要/Abstract

摘要：

目的利用环介导等温扩增（LAMP）技术建立非小细胞肺癌（NSCLC）患者外周血靶点表皮生长因子受体（EGFR）基因L858R位点突变的快速筛查方法。方法在Genebank上查找EGFR 21号外显子（L858R）的DNA序列,利用Primer Explorer V4软件设计特异性引物,建立LAMP检测方法,并对其特异性和敏感性进行评价。采集11例临床病理诊断为NSCLC患者外周血血浆,以聚合酶链反应（PCR）扩增结果为标准,对建立的LAMP方法的准确性进行验证。结果采用自行设计的LAMP引物及构建的反应体系可特异性扩增EGFR L858R位点突变阳性DNA,检测敏感性为0.1%,特异性达到100%。LAMP法在11例EGFR L858R位点突变阳性的NSCLC患者血浆标本中检测到9例阳性。结论成功建立了LAMP检测人外周血浆EGFR基因突变方法,诊断敏感性、特异性和准确性均较高,可荧光目测判读检测结果,是一种简单、快速的EGFR基因突变筛查方法。

关键词: 环介导等温扩增, 表皮生长因子受体, 循环肿瘤DNA, 即时检验

Abstract:

Objective To establish a rapid screening method for epidermal growth factor receptor（EGFR） gene L858R mutation in peripheral blood by loop-mediated isothermal amplification（LAMP） among non-small cell lung cancer（NSCLC） patients. Methods The DNA sequence of exon 21（L858R） of EGFR gene was searched in Genebank,and then the Primer Explorer V4 software was used to design specific primers. LAMP was established,and the specificity and sensitivity were evaluated. Peripheral plasma of 11 patients with NSCLC diagnosed by clinical pathology was collected,and the accuracy of LAMP was verified using the amplification results of digital polymerase chain reaction（PCR） as standard. Results EGFR gene L858R mutant DNA can be specifically amplified by LAMP primer and reaction system designed by ourselves. The detection sensitivity was 0.1 %,and the specificity reached 100%. LAMP detected 9 positive cases in 11 NSCLC specimens with EGFR gene L858R mutation positive results. Conclusions The LAMP has been established for detecting EGFR gene mutation in human peripheral plasma,which has high sensitivity,specificity and accuracy. It can be used to visually interpret the detection results by fluorescence. It is a simple and rapid screening method for EGFR gene mutation.

Key words: Loop-mediated isothermal amplification, Epidermal growth factor receptor, Circulating tumor DNA, Point-of-care testing

中图分类号:

R446.1

钮静, 权文强, 李冬. LAMP技术检测非小细胞肺癌患者外周血EGFR基因L858R位点突变方法的建立及应用[J]. 检验医学, 2020, 35(3): 273-277.

NIU Jing, QUAN Wenqiang, LI Dong. Establishment and application of loop-mediated isothermal amplification for EGFR gene L858R mutation determination in non-small cell lung cancer patients[J]. Laboratory Medicine, 2020, 35(3): 273-277.

图/表 6

图1 LAMP扩增原理

图2 LAMP反应结果注：（a）荧光目测结果;（b）琼脂糖凝胶电泳结果

图3 LAMP敏感性验证结果注：（a）荧光目测结果;（b）琼脂糖凝胶电泳结果;1~5分别为含100%、10%、1%、0.1%、0.01%突变负荷标准品的扩增产物

图4 LAMP特异性验证注：1~9号管为9名体检健康者标本,10号管为阴性对照,11号管为阳性对照,12号管是水

图5 突变阳性标本检测结果注：1~11号管为11例突变阳性标本,12号管为阴性对照,13号管为阳性对照,14号管为水

图6 微流控芯片检测结果注：（a）设计制作的微流控芯片;（b）微流控芯片检测结果

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LAMP技术检测非小细胞肺癌患者外周血EGFR基因L858R位点突变方法的建立及应用

Establishment and application of loop-mediated isothermal amplification for EGFR gene L858R mutation determination in non-small cell lung cancer patients

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