耐碳青霉烯肠杆菌科细菌碳青霉烯酶检测与多位点序列分型分析

doi:10.3969/j.issn.1673-8640.2019.07.001

摘要/Abstract

摘要：

目的了解耐碳青霉烯肠杆菌科细菌（CRE）的耐药机制及分子流行病学特征。方法采用全自动微生物鉴定系统鉴定菌株,并进行药物敏感性试验;采用改良碳青霉烯类灭活试验（mCIM）筛查菌株碳青霉烯酶;采用聚合酶链反应（PCR）及基因测序方法检测菌株碳青霉烯酶耐药基因;采用多位点序列分型（MLST）方法对菌株进行分子分型。结果共收集到24株CRE,其中13株为肺炎克雷伯菌,11株为阴沟肠杆菌,mCIM阳性率均为100%。13株肺炎克雷伯菌中有10株携带bla_KPC-2基因,1株携带bla_NDM-1基因,1株携带bla_NDM-4基因,1株未检出bla_KPC、bla_IMP、bla_VIM、bla_NDM及bla_OXA基因;11株阴沟肠杆菌均携带bla_NDM-1基因。MLST结果显示13株肺炎克雷伯菌中有12株为ST11型,1株为ST571型;11株阴沟肠杆菌均为ST93型。结论研究涉及的肺炎克雷伯菌碳青霉烯类耐药的主要机制为携带bla_KPC-2基因,优势序列分型（ST）为ST11;阴沟肠杆菌碳青霉烯类耐药的主要机制为携带bla_NDM-1基因,优势ST为ST93。应及时采取有效措施防止CRE的传播。

关键词: 碳青霉烯酶, 多位点序列分型, 耐药性, 肺炎克雷伯菌, 阴沟肠杆菌

Abstract:

Objective To study the carbapenem resistance mechanism and molecular epidemiology of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae（CRE）. Methods The identification of bacteria was performed by automatic microbial identification and analysis system. The drug susceptibility test was performed. The modified carbapenem inactivation method（mCIM） was used to screen carbapenemase,and the drug resistance genes of carbapenemase were detected by polymerase chain reaction（PCR）and gene sequencing. The molecular typing was carried out by multilocus sequence typing（MLST） analysis. Results A total of 13 carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae and 11 carbapenem-resistant Enterobacter cloacae were collected. The positive rate of mCIM was 100%. In the 13 carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,10 isolates carried bla_KPC-2,1 isolate carried bla_NDM-1,and 1 isolate carried bla_NDM-4,1 isolate was not detected bla_KPC,bla_IMP,bla_VIM,bla_NDM and bla_OXA. The 11 carbapenem-resistant Enterobacter cloacae carried bla_NDM-1. MLST results showed that in the 13 carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,12 isolates were ST11,and 1 isolate was ST571,while the 11 carbapenem-resistant Enterobacter cloacae were ST93. Conclusions The main mechanism of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae is carrying bla_KPC-2,and the dominant sequence type（ST） is ST11. The main mechanism of carbapenem-resistant Enterobacter cloacae is carrying bla_NDM-1,and the dominant is ST93.

Key words: Carbapenemase, Multilocus sequence typing, Drug resistance, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae

中图分类号:

R446.5

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图/表 5

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基因名称	引物序列（5'~3'）	产物长度（bp）
KPC	F：CGGGATCCATGTCACTGTATCGCCGTC	899
	R：CGGAATTCTTACTGCCCGTTAACGCC
IMP	F：GGAATAGAGTGGCTTAAYTCTC	587
	R：TACAGCAAGCGCTGAGTAAC
NDM	F：GAATGTCTGGCAGCACACTT	480
	R：TTGGCCTTGCTGTCCTTGAT
NDM-1	F：GCTCTAGAATGGAATTGCCCAATATTAT	829
	R：CGGAATTCTCAGCGCAGCTTGTCGGCCA
VIM	F：TCTACATGACCGCGTCTGTC	748
	R：TGTGCTTGACAACGTTCGC
OXA-23-like	F：GATCGGATTGGAGAACCAGA-3′	501
	R：ATTTCTGACCGCATTTCCAT-3′
OXA-24-like	F：GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA-3′	246
	R：AGTTGAGCGAAAAGGGGATT-3′
OXA-51-like	F：TAATGCTTTGATCGGCCTTG	353
	R：TGGATTGCACTTCATCTTGG
OXA-58-like	F：AAGTATTGGGGCTTGTGCTG	599
	R：CCCCTCTGCGCTCTACATAC

基因名称	引物序列（5'~3'）	产物长度（bp）
KPC	F：CGGGATCCATGTCACTGTATCGCCGTC	899
	R：CGGAATTCTTACTGCCCGTTAACGCC
IMP	F：GGAATAGAGTGGCTTAAYTCTC	587
	R：TACAGCAAGCGCTGAGTAAC
NDM	F：GAATGTCTGGCAGCACACTT	480
	R：TTGGCCTTGCTGTCCTTGAT
NDM-1	F：GCTCTAGAATGGAATTGCCCAATATTAT	829
	R：CGGAATTCTCAGCGCAGCTTGTCGGCCA
VIM	F：TCTACATGACCGCGTCTGTC	748
	R：TGTGCTTGACAACGTTCGC
OXA-23-like	F：GATCGGATTGGAGAACCAGA-3′	501
	R：ATTTCTGACCGCATTTCCAT-3′
OXA-24-like	F：GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA-3′	246
	R：AGTTGAGCGAAAAGGGGATT-3′
OXA-51-like	F：TAATGCTTTGATCGGCCTTG	353
	R：TGGATTGCACTTCATCTTGG
OXA-58-like	F：AAGTATTGGGGCTTGTGCTG	599
	R：CCCCTCTGCGCTCTACATAC

菌株编号	厄他培南	亚胺培南	美罗培南	头孢噻肟	头孢他啶	头孢吡肟	哌拉西林-他唑巴坦	阿莫西林-克拉维酸	氨曲南	阿米卡星	环丙沙星	替加环素	多黏菌素
1	>64	64	>64	256	>256	128	>256	>256	>256	>256	128	2	≤0.25
2	64	8	8	>256	>256	128	>256	128	>256	8	1	2	0.5
3	>64	64	>64	>256	>256	>256	>256	>256	>256	>256	128	2	≤0.25
4	>64	32	>64	>256	>256	>256	>256	>256	>256	>256	64	2	≤0.25
5	>64	64	>64	>256	>256	>256	>256	>256	>256	>256	128	2	0.5
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菌株编号	厄他培南	亚胺培南	美罗培南	头孢噻肟	头孢他啶	头孢吡肟	哌拉西林-他唑巴坦	阿莫西林-克拉维酸	氨曲南	阿米卡星	环丙沙星	替加环素	多黏菌素
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15	>64	16	16	>256	>256	>256	>256	256	>256	>256	128	2	0.5
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17	8	8	8	>256	>256	128	>256	256	>256	2	64	2	≤0.25
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菌株编号	厄他培南	亚胺培南	美罗培南	头孢噻肟	头孢他啶	头孢吡肟	哌拉西林-他唑巴坦	阿莫西林-克拉维酸	氨曲南	阿米卡星	环丙沙星	替加环素	多黏菌素
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菌株编号	厄他培南	亚胺培南	美罗培南	头孢噻肟	头孢他啶	头孢吡肟	哌拉西林-他唑巴坦	阿莫西林-克拉维酸	氨曲南	阿米卡星	环丙沙星	替加环素	多黏菌素
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20	32	8	8	>256	>256	64	>256	256	>256	>256	64	2	≤0.25
21	8	16	16	>256	>256	64	>256	256	>256	>256	128	2	1
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24	8	32	16	>256	>256	128	>256	256	>256	2	64	2	≤0.25

菌株编号	科室来源	样本类型	分离日期	疾病	耐药基因	ST
1	重症监护病房3区	痰液	2016-01-22	呼吸衰竭	bla_KPC-2	11
2	脑科1区	中段尿	2016-04-01	腹痛查因	bla_NDM-1	571
3	脑科1区	中段尿	2016-04-24	颅内血肿	bla_KPC-2	11
4	重症监护病房2区	痰液	2016-06-23	脑梗塞	bla_KPC-2	11
5	呼吸内科2区	痰液	2016-06-23	肺结核	bla_KPC-2	11
6	泌尿外科	中段尿	2016-07-06	左肾结石	bla_NDM-4	11
7	脑科5区	中段尿	2016-08-05	脑出血	bla_KPC-2	11
8	肾内科	中段尿	2016-08-27	梗阻性肾病	bla_KPC-2	11
9	脑科5区	中段尿	2016-11-24	脑出血	bla_KPC-2	11
10	呼吸内科2区	痰液	2016-12-07	脑梗塞	bla_KPC-2	11
11	脑科5区	中段尿	2016-12-15	脑出血	bla_KPC-2	11
12	脑科5区	中段尿	2017-02-10	脑出血	bla_KPC-2	11
13	脑科1区	中段尿	2017-02-22	脑外伤		11
14	脑科5区	中段尿	2015-08-21	脑血管意外	bla_NDM-1	93
15	脑科1区	中段尿	2015-10-14	脑挫裂伤	bla_NDM-1	93
16	脑科1区	中段尿	2015-11-08	脑挫裂伤	bla_NDM-1	93
17	脑科5区	中段尿	2015-11-09	脑血管意外	bla_NDM-1	93
18	脑科5区	中段尿	2015-12-06	脑出血	bla_NDM-1	93
19	脑科1区	中段尿	2015-12-19	脑挫裂伤	bla_NDM-1	93
20	脑科5区	中段尿	2016-01-22	脑血管意外	bla_NDM-1	93
21	脑科1区	中段尿	2016-01-23	脑出血	bla_NDM-1	93
22	脑科5区	中段尿	2016-04-22	脑出血	bla_NDM-1	93
23	脑科5区	中段尿	2016-09-24	脑挫裂伤	bla_NDM-1	93
24	脑科5区	中段尿	2016-11-21	脑出血	bla_NDM-1	93