液相色谱串联质谱法测定血清中25-羟基维生素D2及25-羟基维生素D3含量

doi:10.3969/j.issn.1673-8640.2015.08.012

摘要/Abstract

摘要：

目的建立液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)测定血清25-羟基维生素D2[25(OH)D2]及25-羟基维生素D3[25(OH)D3]含量的方法。方法采用乙醇沉淀蛋白,正己烷液液萃取目标组分,乙腈复溶。采用LC-MS/MS[正离子电喷雾离子化(ESI+)的多反应监测模式(MRM)] 氘代同位素内标法检测血清25(OH)D2及25(OH)D3含量并进行相关方法学验证。结果 LC-MS/MS检测血清25(OH)D2及25(OH)D3的批内精密度为0.88%~7.69%,批间精密度为1.56%~9.90%;25(OH)D2在0.5~10.0 ng/mL、 25(OH)D3在5~100 ng/mL范围内线性良好,线性相关系数分别为0.999 1、0.999 9,校准品测试结果正确度为95.5%~101.2%。281名志愿者男、女之间25(OH)D2含量差异无统计学意义(P>0.05), 25(OH)D3含量差异有统计学意义(P<0.05)。结论 LC-MS/MS检测血清25(OH)D2及25(OH)D3的敏感性高,结果准确、稳定,可应用于临床分析。

关键词: 25-羟基维生素D2, 25-羟基维生素D3, 液相色谱串联质谱, 内标法, 血清

Abstract:

Objective To establish a method for the determinations of 25-hydroxyvitamin D2[25(OH)D2]and 25- hydroxyvitamin D3[25(OH)D3] contents in serum by liquid chromatography tandem-mass spectrometry (LC-MS/MS). Methods After proteins in serum were precipitated by ethanol, liquid-liquid extraction by n-Hexane, then the residuals were re-dissolved in acetonitrile and analyzed by LC-MS/MS in the positive electrospray ionization(ESI+) mode and multiple reaction monitor(MRM) mode. The quantitative analysis for 25(OH)D2 and 25(OH)D3 contents was carried out by deuterium isotope as internal standard, and the methodology validation was performed. Results The within-run precision of 25(OH)D2 and 25(OH)D3 was 0.88%-7.69%, and between-run precision was 1.56%-9.90%. The good correlation coefficients were 0.999 1 and 0.999 9 at the concentration of 0.5-10.0 ng/mL 25(OH)D2 and 5-100 ng/mL 25(OH)D3, respectively. The accuracy of quality control materials of 25(OH)D2 and 25(OH)D3 was 95.5%-101.2%. 25(OH)D2 content did not have statistical significance(P>0.05), and 25(OH)D3 content had statistical significance(P<0.05)between males and females of 281 volunteers. Conclusions This method is sensitive, accurate and stable, satisfying the quantification requirements of 25(OH)D2 and 25(OH)D3 in serum, and it can be used in clinical analysis.

Key words: 25-hydroxyvitamin D2, 25-hydroxyvitamin D3, Liquid chromatography tandem-mass spectrometry, Internal standard method, Serum

中图分类号:

R446.1

徐凤仙, 于嘉屏. 液相色谱串联质谱法测定血清中25-羟基维生素D2及25-羟基维生素D3含量[J]. 检验医学, 2015, 30(8): 821-824.

XU Fengxian, YU Jiaping.. Determinations of 25-hydroxyvitamin D2 and 25-hydroxyvitamin D3 in serum by liquid chromatography tandem-mass spectrometry[J]. Laboratory Medicine, 2015, 30(8): 821-824.

图/表 11

表1 流动相梯度洗脱程序

时间	流速(mL/min)	水(0.2%甲酸)∶ 甲醇(0.2甲酸)
0 min 1 s	0.40	70∶30
0 min 45 s	0.40	70∶30
1 min 30 s	0.50	17∶83
3 min 45 s	0.55	3∶97
4 min 30 s	0.55	3∶97
5 min 0 s	0.40	70∶30
6 min 0 s	0.40	70∶30

图1 25(OH)D2标准曲线图

图2 25(OH)D3标准曲线图

图3 25(OH)D2及25(OH)D3色谱图

表2 25(OH)D2的精密度

25(OH)D2	批内精密度			批间精密度
25(OH)D2	$x ?$ (ng/mL)	s	变异系数(%)	$x ?$ (ng/mL)	s	变异系数(%)
高值	6.03	0.27	4.47	5.65	0.39	6.89
中值	2.61	0.19	6.48	2.75	0.20	7.21
低值	1.03	0.08	7.69	1.08	0.11	9.90

表2 25(OH)D2的精密度

25(OH)D2	批内精密度			批间精密度
25(OH)D2	$x ?$ (ng/mL)	s	变异系数(%)	$x ?$ (ng/mL)	s	变异系数(%)
高值	6.03	0.27	4.47	5.65	0.39	6.89
中值	2.61	0.19	6.48	2.75	0.20	7.21
低值	1.03	0.08	7.69	1.08	0.11	9.90

表3 25(OH)D3的精密度

25(OH)D3	批内精密度			批间精密度
25(OH)D3	$x ?$ (ng/mL)	s	变异系数(%)	$x ?$ (ng/mL)	s	变异系数(%)
高值	58.18	0.51	0.88	58.45	0.91	1.56
中值	29.8	0.44	1.47	29.42	0.72	2.46
低值	10.42	0.16	1.54	10.23	0.42	4.13

表3 25(OH)D3的精密度

25(OH)D3	批内精密度			批间精密度
25(OH)D3	$x ?$ (ng/mL)	s	变异系数(%)	$x ?$ (ng/mL)	s	变异系数(%)
高值	58.18	0.51	0.88	58.45	0.91	1.56
中值	29.8	0.44	1.47	29.42	0.72	2.46
低值	10.42	0.16	1.54	10.23	0.42	4.13

表4 校准品检测结果

级别	项目	靶值 (ng/mL)	允许区间下限 (ng/mL)	允许区间上限 (ng/mL)	测定结果 (ng/mL)	正确度 (%)
L1	25(OH)D2	17.6	14.1	21.1	16.8	95.5
L1	25(OH)D3	16.3	13.1	19.6	16.5	101.2
L2	25(OH)D2	41.4	33.1	49.7	41.0	99.0
L2	25(OH)D3	38.0	30.4	45.6	37.9	99.7

参考区间	男性			女性
参考区间	25(OH)D2	25(OH)D3	25(OH)D	25(OH)D2	25(OH)D3	25(OH)D
下限	0.46	12.30	13.23	0.51	10.90	11.87
上限	1.65	29.90	30.62	1.61	26.60	27.35

参考区间	25(OH)D2	25(OH)D3	25(OH)D
下限	0.51	11.3	12.39
上限	1.7	29.9	30.78

参考文献 9

[1]	周建烈,杨宗麟. 维生素D补充与药物选择[J]. 上海医药, 2011,32(10):472-474.
[2]	王剑,朱玮琪,沈立松. 高效液相色谱法测定血清中25-羟基维生素D3[J]. 检验医学,2008,23(4):380-383.
[3]	SAENGER AK,LAHA TJ,BREMNER DE, et al.Quantification of serum 25-hydroxyvitamin D(2) and D(3) using HPLC-tandem mass spectrometry and examination of reference intervals for diagnosis of vitamin D deficiency[J]. Am J Clin Pathol,2006,125(6): 914-920.
[4]	HØJSKOV CS,HEICKENDORFF L,MØLLER HJ. High-throughput liquid-liquid extraction and LCMSMS assay for determination of circulating 25(OH) vitamin D3 and D2 in the routine clinical laboratory[J].Clin Chim Acta,2010,411(1-2): 114-116.
[5]	VAN DEN OUWELAND JM,BEIJERS AM,DEMACKER PN,et al. Measurement of 25-OH-vitamin D in human serum using liquid chromatography tandem-mass spectrometry with comparison to radioimmunoassay and automated immunoassay[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2010,878(15-16): 1163-1168.
[6]	毛旭东,吴彦,盛宏光,等. 液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)和酶联免疫法(ELISA)对体内25(OH) D3水平的测定[J]. 中国骨质疏松杂志,2013,19(6):584-586.
[7]	王春平,毛旭东,盛宏光. 上海市徐汇区住院患者血中维生素D水平分析[J]. 中国临床医学,2014,21(1):75-77.
[8]	熊燏,钱士匀,熊小泉,等. 海南地区成人血清25-羟基-维生素D参考区间的初步调查[J].检验医学,2014,29(5):464-467.
[9]	HOLICK MF,BINKLEY NC,BISCHOFF-FERRARI HA,et al.Evaluation,treatment,and prevention of vitamin D deficiency: an endocrine society clinical practice guideline[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2011,96(7): 1911-1930.

[1]	李西就, 周健伟, 张芹, 龙允麟, 吴英松. 滤纸干血片6种标志物UPLC-MS/MS方法的建立和性能评价[J]. 检验医学, 2023, 38(5): 446-453.
[2]	徐炜新, 陈青, 杜文永, 高燕. 睡眠障碍患者血浆代谢标志物研究[J]. 检验医学, 2023, 38(5): 454-459.
[3]	多囊卵巢综合征雄激素质谱检测共识专家组. 多囊卵巢综合征雄激素质谱检测专家共识[J]. 检验医学, 2023, 38(3): 203-208.
[4]	杨晓东, 李全乐, 潘清清, 周静, 谢阳敏, 邹继华, 沈敏, 张曼. 全血免疫抑制剂ID-LC-MS/MS候选参考方法的建立和性能评价[J]. 检验医学, 2023, 38(3): 215-222.
[5]	王亚捷, 祖白玲, 甘辰欣, 武娇祥, 殳洁, 杭晨, 陈明晖, 林芙君, 胡志刚, 黄飚, 盛慧明. PLA2R1相关膜性肾病患者血浆差异表达多肽的鉴定[J]. 检验医学, 2023, 38(3): 223-229.
[6]	邓晨, 戴家泽, 邱丽红, 沈威廷, 蔡木发, 罗文英. 湛江地区高毒力肺炎克雷伯菌分子流行特征[J]. 检验医学, 2023, 38(11): 1026-1031.
[7]	黄媛, 陈锋, 毛镭篥, 张陵林, 吕倩, 闫军, 崔巍. 基于MALDI-TOF MS的血清多肽组学在胰腺良恶性疾病鉴别诊断中的应用[J]. 检验医学, 2023, 38(1): 1-7.
[8]	胡韶华, 陈黎, 赵梦, 马展, 张泓. 上海地区儿童肺炎支原体感染流行病学特征分析[J]. 检验医学, 2023, 38(1): 14-17.
[9]	张濛, 李莎, 常艳丽, 王鲁, 徐建军, 张青云. 血管内皮生长因子在黑色素瘤疗效监测和预后判断中的价值[J]. 检验医学, 2022, 37(9): 821-825.
[10]	韩静贤, 庞丽, 王勇. 多发性硬化患者血清和脑脊液IL-33的表达及其临床意义[J]. 检验医学, 2022, 37(9): 844-846.
[11]	葛丹红, 方慧玲, 林斐然, 朱宇清. 模拟急诊生化标本不同仪器检测效率比较[J]. 检验医学, 2022, 37(8): 766-771.
[12]	刘婧娴, 陈星月, 赵晶, 刘瑛. 非妊娠成人无乳链球菌感染临床特点及分子流行病学研究进展[J]. 检验医学, 2022, 37(8): 793-797.
[13]	李雪文, 徐攀洋, 何冰, 邢东洋, 夏薇, 许建成. 间接法建立长春地区成人血清淀粉酶参考区间[J]. 检验医学, 2022, 37(5): 493-495.
[14]	韩光, 徐琼峰, 段淑敏, 骆嘉欢, 王云秀, 张秀娟, 万泽民, 柯培锋, 黄宪章. 依据CLSI EP07-A3文件评价血清指数对免疫散射比浊法检测前白蛋白的干扰[J]. 检验医学, 2022, 37(2): 108-111.
[15]	陆优丽, 杨双双, 张美微, 欧美贤, 董春霞, 沈薇薇, 姜凤丽, 李水军. 超高效液相色谱串联质谱同时检测人血清5种甾体激素方法学及生物参考区间的建立[J]. 检验医学, 2022, 37(2): 165-173.