全血免疫抑制剂ID-LC-MS/MS候选参考方法的建立和性能评价

doi:10.3969/j.issn.1673-8640.2023.03.003

检验医学 ›› 2023, Vol. 38 ›› Issue (3): 215-222.DOI: 10.3969/j.issn.1673-8640.2023.03.003

全血免疫抑制剂ID-LC-MS/MS候选参考方法的建立和性能评价

杨晓东¹, 李全乐¹, 潘清清¹, 周静¹, 谢阳敏¹, 邹继华¹(), 沈敏¹(), 张曼²

1.美康生物科技股份有限公司参考实验室，浙江宁波 315104
2. 首都医科大学附属北京世纪坛医院检验科，北京 100038

收稿日期:2022-01-18 修回日期:2022-12-07 出版日期:2023-03-28 发布日期:2023-05-24
通讯作者: 邹继华,沈敏
作者简介:邹继华，E-mail：jihua.zou@nbmedicalsystem.com；
杨晓东，男，1989年生，硕士，工程师，主要从事体外诊断试剂量值溯源和研发工作。
基金资助:
国家重点研发计划(2019YFF0216504);宁波市重大科技攻关项目(2021Z055)

Establishment and performance evaluation of candidate reference measurement procedure for the determination of immunosuppressive drugs in human whole blood by ID-LC-MS/MS

YANG Xiaodong¹, LI Quanle¹, PAN Qingqing¹, ZHOU Jing¹, XIE Yangmin¹, ZOU Jihua¹(), SHEN Min¹(), ZHANG Man²

1. Reference Laboratory，MedicalSystem Biotechnology Co.，Ltd.，Ningbo 315104，Zhejiang，China
2. Department of Clinical Laboratory，Beijing Shijitan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100038，China

Received:2022-01-18 Revised:2022-12-07 Online:2023-03-28 Published:2023-05-24
Contact: ZOU Jihua,SHEN Min

摘要/Abstract

摘要：

目的建立同位素稀释液相色谱串联质谱（ID-LC-MS/MS）检测全血免疫抑制剂（他克莫司、西罗莫司、依维莫司和环孢素A）的候选参考方法，并评价其性能。方法采用蛋白沉淀法（PPT）对全血样本进行前处理，采用ID-LC-MS/MS定量检测他克莫司、西罗莫司、依维莫司和环孢素A。对建立的候选参考方法的分析性能（线性、定量限、基质效应、精密度和正确度等）进行评估。结果 ID-LC-MS/MS检测他克莫司、西罗莫司、依维莫司和环孢素A的总检测时间为4.5 min；环孢素A的线性范围为10~500 ng/mL，定量限为10 ng/mL；他克莫司、西罗莫司和依维莫司的线性范围均为1~50 ng/mL，定量限均为1 ng/mL。4种免疫抑制剂的相对基质效应范围均≤8.64%，批内、批间变异系数（CV）均≤5%，加标回收率为98.84%~100.99%。他克莫司的扩展测量不确定度≤7.91%（k=2）、西罗莫司≤7.97%（k=2），依维莫司≤7.14%（k=2），环孢素A≤7.91%（k=2）。结论成功建立了ID-LC-MS/MS检测全血他克莫司、西罗莫司、依维莫司和环孢素A的候选参考方法，可用于相关项目的量值溯源和标准化。

关键词: 免疫抑制剂, 同位素稀释液相色谱串联质谱, 参考方法, 性能评估

Abstract:

Objective To establish a candidate reference measurement procedure for immunosuppressive drugs（tacrolimus，sirolimus，everolimus and cyclosporine A） in human whole blood by isotope-dilution liquid chromatography-tandem mass spectrometry（ID-LC-MS/MS），and to evaluate its analytical performance. Methods Human whole blood samples were prepared by a simple protein precipitation method，and ID-LC-MS/MS was used to determine tacrolimus，sirolimus，everolimus and cyclosporine A quantitatively. The performance，including linearity，limit of quantitation，relative matrix effect，precision and trueness，were evaluated. Results ID-LC-MS/MS allowed the determination of the 4 immunosuppressive drugs within a total runtime of 4.5 min. ID-LC-MS/MS allowed the determination of cyclosporine A in the range of 10-500 ng/mL. Tacrolimus，sirolimus and everolimus were analyzed in the range of 1-50 ng/mL. The limit of quantitation was 10 ng/mL for cyclosporine A and 1 ng/mL for the others. The relative matrix effects were ≤8.64%. The precisions for intra-day and inter-day coefficients of variation（CV） were ≤5%. The average recovery rates were found to be 98.84%-100.99% for the 4 immunosuppressive drugs. Expanded measurement uncertainties were found to be ≤7.91 % for tacrolimus（k=2），≤7.97 % for sirolimus（k=2），≤7.14 % for everolimus（k=2） and ≤7.91 % for cyclosporine A（k=2）. Conclusions The candidate reference measurement procedure for tacrolimus，sirolimus，everolimus and cyclosporine A in human whole blood by ID-LC-MS/MS has been established successfully，which can be used in value traceability and standardization.

Key words: Immunosuppressive drug, Isotope-dilution liquid chromatography-tandem mass spectrometry, Reference measurement procedure, Performance evaluation

中图分类号:

R446.1

杨晓东, 李全乐, 潘清清, 周静, 谢阳敏, 邹继华, 沈敏, 张曼. 全血免疫抑制剂ID-LC-MS/MS候选参考方法的建立和性能评价[J]. 检验医学, 2023, 38(3): 215-222.

YANG Xiaodong, LI Quanle, PAN Qingqing, ZHOU Jing, XIE Yangmin, ZOU Jihua, SHEN Min, ZHANG Man. Establishment and performance evaluation of candidate reference measurement procedure for the determination of immunosuppressive drugs in human whole blood by ID-LC-MS/MS[J]. Laboratory Medicine, 2023, 38(3): 215-222.

图/表 8

参考文献 13

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名称	定量/定性	母离子/（m/z）	子离子/（m/z）	去簇电压/V	碰撞能量/V
他克莫司	定量	821.7	768.6	150	27
	定性	821.7	786.6	150	22
他克莫司-¹³Cd₄	定量	826.7	773.6	150	27
西罗莫司	定量	931.7	864.7	150	24
	定性	931.7	882.6	150	16
西罗莫司-d₃	定量	934.7	864.6	150	24
依维莫司	定量	975.7	908.7	150	24
	定性	975.6	926.7	150	18
依维莫司-d₄	定量	979.7	912.7	150	24
环孢素A	定量	1 219.9	1 202.9	150	50
	定性	1 219.9	1 184.9	150	47
环孢素A-d₄	定量	1 223.9	1 206.9	150	50

名称	定量/定性	母离子/（m/z）	子离子/（m/z）	去簇电压/V	碰撞能量/V
他克莫司	定量	821.7	768.6	150	27
	定性	821.7	786.6	150	22
他克莫司-¹³Cd₄	定量	826.7	773.6	150	27
西罗莫司	定量	931.7	864.7	150	24
	定性	931.7	882.6	150	16
西罗莫司-d₃	定量	934.7	864.6	150	24
依维莫司	定量	975.7	908.7	150	24
	定性	975.6	926.7	150	18
依维莫司-d₄	定量	979.7	912.7	150	24
环孢素A	定量	1 219.9	1 202.9	150	50
	定性	1 219.9	1 184.9	150	47
环孢素A-d₄	定量	1 223.9	1 206.9	150	50

项目	理论浓度/（ng/mL）	测定均值/（ng/mL）	CV/%	偏移/%
样本1
他克莫司	0.26	0.28	7.23	7.69
西罗莫司	0.26	0.25	7.92	-3.85
依维莫司	0.26	0.19	10.80	-26.92
环孢素A	2.54	0.91	13.14	-64.17
样本2
他克莫司	0.52	0.55	3.63	5.77
西罗莫司	0.52	0.53	7.57	1.92
依维莫司	0.52	0.47	4.27	-9.62
环孢素A	5.10	3.81	5.51	-25.29
样本3
他克莫司	0.78	0.83	3.60	6.41
西罗莫司	0.78	0.80	4.98	2.56
依维莫司	0.78	0.73	2.73	-6.41
环孢素A	7.62	6.56	3.97	-13.91
样本4
他克莫司	1.03	1.10	4.54	6.80
西罗莫司	1.02	1.07	3.74	4.90
依维莫司	1.03	1.02	3.93	-0.97
环孢素A	10.03	9.44	3.18	-5.88

项目	理论浓度/（ng/mL）	测定均值/（ng/mL）	CV/%	偏移/%
样本1
他克莫司	0.26	0.28	7.23	7.69
西罗莫司	0.26	0.25	7.92	-3.85
依维莫司	0.26	0.19	10.80	-26.92
环孢素A	2.54	0.91	13.14	-64.17
样本2
他克莫司	0.52	0.55	3.63	5.77
西罗莫司	0.52	0.53	7.57	1.92
依维莫司	0.52	0.47	4.27	-9.62
环孢素A	5.10	3.81	5.51	-25.29
样本3
他克莫司	0.78	0.83	3.60	6.41
西罗莫司	0.78	0.80	4.98	2.56
依维莫司	0.78	0.73	2.73	-6.41
环孢素A	7.62	6.56	3.97	-13.91
样本4
他克莫司	1.03	1.10	4.54	6.80
西罗莫司	1.02	1.07	3.74	4.90
依维莫司	1.03	1.02	3.93	-0.97
环孢素A	10.03	9.44	3.18	-5.88

项目	加入量/ng	测定值/ng	回收率/ %	平均回收率/%	CV/%	项目	加入量/ng	测定值/ng	回收率/ %	平均回收率/%	CV/%
他克莫司						依维莫司
加标样本1	0.493	0.484	98.17	99.63	1.54	加标样本1	0.495	0.491	99.19	100.99	1.12
	0.482	0.472	97.93				0.484	0.490	101.24
	0.486	0.489	100.62				0.488	0.499	102.25
	0.474	0.474	100.00				0.476	0.480	100.84
	0.487	0.494	101.44				0.489	0.496	101.43
加标样本2	2.435	2.391	98.19	99.04	1.09	加标样本2	2.444	2.477	101.35	99.40	1.66
	2.483	2.499	100.64				2.493	2.508	100.60
	2.459	2.407	97.89				2.468	2.458	99.60
	2.502	2.485	99.32				2.512	2.450	97.53
	2.451	2.431	99.18				2.460	2.409	97.93
加标样本3	4.988	4.916	98.56	99.27	0.60	加标样本3	5.007	5.013	100.12	100.76	0.63
	5.158	5.147	99.79				5.177	5.261	101.62
	4.848	4.821	99.44				4.866	4.874	100.16
	4.893	4.831	98.73				4.911	4.961	101.02
	4.826	4.819	99.85				4.844	4.887	100.89
西罗莫司						环孢素A
加标样本1	0.494	0.488	98.79	99.34	1.33	加标样本1	4.921	4.945	100.49	100.56	1.21
	0.483	0.487	100.83				4.815	4.830	100.31
	0.487	0.483	99.18				4.854	4.928	101.53
	0.476	0.466	97.90				4.737	4.822	101.79
	0.488	0.488	100.00				4.860	4.797	98.70
加标样本2	2.440	2.429	99.55	99.26	0.70	加标样本2	24.309	23.900	98.32	99.77	1.29
	2.489	2.482	99.72				24.795	25.168	101.50
	2.465	2.459	99.76				24.552	24.564	100.05
	2.508	2.487	99.16				24.982	25.058	100.30
	2.456	2.409	98.09				24.469	24.142	98.66
加标样本3	5.000	5.008	100.16	99.52	1.03	加标样本3	49.803	49.077	98.54	98.84	0.65
	5.170	5.071	98.09				51.495	50.972	98.98
	4.859	4.808	98.95				48.403	48.230	99.64
	4.904	4.889	99.69				48.851	48.413	99.10
	4.837	4.872	100.72				48.186	47.189	97.93

全血免疫抑制剂ID-LC-MS/MS候选参考方法的建立和性能评价

Establishment and performance evaluation of candidate reference measurement procedure for the determination of immunosuppressive drugs in human whole blood by ID-LC-MS/MS

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项目	批内均值/（ng/mL）	批内CV/%	总均值/（ng/mL）	批间CV/%	项目	批内均值/（ng/mL）	批内CV/%	总均值/（ng/mL）	批间CV/%
他克莫司					依维莫司
低值质控					低值质控
批次1	2.55	3.65	2.53	0.79	批次1	2.54	4.21	2.52	0.60
批次2	2.53	4.78			批次2	2.52	4.64
批次3	2.51	4.78			批次3	2.51	3.59
中值质控					中值质控
批次1	20.08	3.81	20.25	2.34	批次1	20.43	2.72	20.16	1.51
批次2	20.78	2.01			批次2	19.83	4.00
批次3	19.88	2.33			批次3	20.21	2.85
高值质控					高值质控
批次1	40.20	0.74	40.24	0.41	批次1	39.87	1.26	40.14	0.62
批次2	40.10	1.88			批次2	40.36	1.20
批次3	40.42	1.21			批次3	40.19	1.27
西罗莫司					环孢素A
低值质控					低值质控
批次1	2.49	4.70	2.51	1.04	批次1	24.63	4.75	25.02	1.52
批次2	2.50	4.56			批次2	25.39	4.08
批次3	2.54	4.33			批次3	25.05	4.00
中值质控					中值质控
批次1	20.56	1.85	20.09	2.75	批次1	201.20	4.68	197.12	1.87
批次2	19.48	1.72			批次2	196.11	2.57
批次3	20.23	2.65			批次3	194.04	2.93
高值质控					高值质控
批次1	39.52	1.62	39.41	0.69	批次1	399.22	0.78	397.93	0.35
批次2	39.10	0.21			批次2	396.48	0.36
批次3	39.61	1.21			批次3	398.10	0.82

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