产ESBLs大肠埃希菌对氨基糖苷类药物的耐药性及其耐药基因序列分析

doi:10.3969/j.issn.1673-8640.2016.011.007

摘要/Abstract

摘要：

目的研究云南玉溪市江川地区产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）大肠埃希菌对氨基糖苷类抗菌药物的耐药性及其耐药基因表达的频率,并对其耐药基因进行测序分析。方法采用纸片扩散法检测32株产ESBLs大肠埃希菌对庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素、妥布霉素和奈替米星的耐药性。采用聚合酶链反应（PCR）检测7种氨基糖苷类修饰酶（AME）基因[aac（3）-Ⅰ、aac（3）-Ⅱ、aac（6′）-Ⅰad、aac（6′）-Ⅰb、aac（6′）-Ⅱ、ant（3″）-Ⅰ、ant（2″）-Ⅰ]和6种16S rRNA甲基化酶基因（armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA）,采用双脱氧末端终止法对aac（3）-Ⅱ基因进行测序分析。结果 32株产ESBLs大肠埃希菌对庆大霉素、阿米卡星、奈替米星、卡那霉素和妥布霉素的耐药率分别为100%、0%、0%、18%和87%。有6株菌株同时携带2种AME基因。从32株产ESBLs大肠埃希菌中检出aac（3）-Ⅱ、aac（6′）-Ⅰb、ant（3″）-Ⅰ、ant（2″）-Ⅰ4种AME基因,阳性率分别为100%、9.4%、6.2%和3.1%;未检出16S rRNA甲基化酶基因。32株产ESBLs大肠埃希菌中有4株发生相同的aac（3）-Ⅱ突变,分别为G232A、 T251C、 G580A和 T612A。8株不产ESBLs大肠埃希菌均未检出AME基因及16S rRNA甲基化酶基因。结论云南玉溪市江川地区产ESBLs大肠埃希菌耐氨基糖苷类药物与AME基因表达有关,奈替米星的耐药率增加可能与aac（3）-Ⅱ基因突变有关。

关键词: 大肠埃希菌, 氨基糖苷类修饰酶基因, 16S rRNA甲基化酶基因

Abstract:

Objective To study the drug resistance of extended-spectrum beta-lactamases（ESBLs）-producing Escherichia coli to aminoglycosides and the expression frequencies and sequences of drug resistant genes in Jiangchuan District,Yuxi City,Yunnan Province. Methods The drug resistance of 32 isolates of ESBLs-producing Escherichia coli to gentamycin,amikacin,kanamycin,tobramycin and netilmicin was determined by disk diffusion test. A total of 7 aminoglycoside-modifying enzyme（AME） genes [aac（3）-Ⅰ,aac（3）-Ⅱ,aac（6′）-Ⅰad,aac（6′）-Ⅰb,aac（6′）-Ⅱ,ant（3″）-Ⅰ and ant（2″）-Ⅰ] and 6 genes of 16S rRNA methylases（armA,rmtA,rmtB,rmtC,rmtD and npmA） were determined by polymerase chain reaction（PCR）,and the sequence of aac（3）-Ⅱ gene was analyzed by double deoxidizing terminal cessation method. Results The drug resistant rates of 32 isolates of ESBLs-producing Escherichia coli to gentamycin,amikacin,netilmicin,kanamycin and tobramycin were 100%,0%,0%,18% and 87%,respectively. It was found that 2 AME genes existed simultaneously in 6 isolates. The positive rates of 4 AME genes,aac（3）-Ⅱ,aac（6′）-Ⅰb,ant（3″）-Ⅰ and ant（2″）-Ⅰ,were 100%,9.4%,6.2% and 3.1% in 32 isolates. There was no gene of 16S rRNA methylases. The aac（3）-Ⅱ mutations existed in 4 out of 32 isolates,which were G232A,T251C,G580A and T612A,respectively. There was no gene of AME and 16S rRNA methylases in 8 isolates of ESBLs-producing Escherichia coli. Conclusions The drug resistance of ESBLs-producingEscherichia coli to aminoglycosides was correlated with AME gene expressions,and the mutations of aac（3）-Ⅱ may contribute to the increased drug resistance to netilmicin.

Key words: Escherichia coli, Aminoglycoside-modifying enzyme genes, 16S rRNA methylase gene

中图分类号:

R378.2

吴蓉, 吕玉江, 戴俊华, 相芬芬, 孔倩倩, 钱宁, 张贵留, 杨玉玲, 陈丽春, 康向东. 产ESBLs大肠埃希菌对氨基糖苷类药物的耐药性及其耐药基因序列分析[J]. 检验医学, 2016, 31(11): 959-964.

WU Rong, LÜ Yujiang, DAI Junhua, XIANG Fenfen, KONG Qianqian, QIAN Ning, ZHANG Guiliu, YANG Yuling, CHEN Lichun, KANG Xiangdong. Drug resistance of ESBLs-producing Escherichia coli to aminoglycosides and the sequences of drug resistant genes[J]. Laboratory Medicine, 2016, 31(11): 959-964.

图/表 4

参考文献 17

1	PAGE MG.Extended-spectrum beta-lactamases:structure and kinetic mechanism[J]. Clin Microbiol Infect,2008,14(Suppl 1):63-74.
2	CHATTERJEE SS,CHEN L,JOO HS,et a1. Distribution and regulation of the mobile genetic element-encoded phenol-soluble modulin PSM-mec in methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J]. PLoS One,2011,6(12):e28781.
3	QUECK SY,KHAN BA,WANG R,et a1. Mobile genetic element-encoded cytolysin connects virulence to methicillin resistance in MRSA[J]. PLoS Pathog,2009,5(7):e1000533.
4	MIRAGAIA M,DE LENCASTRE H,PERDREAU-REMINGTON F,et a1. Genetic diversity of arginine catabolic mobile element in Staphylococcus epidermidis[J]. PLoS One,2009,4(11):e7722.
5	LIU H,WANG Y,WANG G,et al.The prevalence of Escherichia coli strains with extended spectrum beta-lactamases isolated in China[J]. Front Microbiol,2015,6:335.
6	TACAO M,MOURA A,CORREIA A,et al.Co-resistance to different classes of antibiotics among ESBL-producers from aquatic systems[J]. Water Res,2014,48:100-107.
7	芮球红,廖于峰,陈燕敏. ICU产ESBLs大肠埃希菌氨基糖苷类修饰酶基因的分析[J]. 检验医学,2013,28(5):452-454.
8	郑为平,史伟峰. 超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌对氨基糖甙类药物耐药性及耐药基因研究[J]. 国际检验医学杂志,2009,30(3):220-222.
9	张淑青. 产ESBLs大肠埃希菌对氨基糖苷类药物耐药基因研究[J]. 中国实验诊断学,2012,16(2):299-301.
10	ZHANG C,XU X,PU S,et al.Characterization of carbapenemases,extended spectrum β-lactamases,quinolone resistance and aminoglycoside resistance determinants in carbapenem-non-susceptible Escherichia coli from a teaching hospital in Chongqing,Southwest China[J]. Infect Genet Evol,2014,27:271-276.
11	蒯守刚,黄利华,裴豪,等. 鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类药物耐药机制研究[J]. 检验医学,2012,27(8): 619-623.
12	彭敬红,侯彦强,谢多双,等. 铜绿假单胞菌16S rRNA甲基化酶基因和氨基糖苷修饰酶基因的研究[J]. 检验医学,2015,30(6): 613-616.
13	罗建华. 产超广谱β内酰胺酶大肠埃希菌中氨基糖苷类修饰酶基因分布研究[D]. 杭州:浙江大学,2011.
14	黄永茂,游春芳,张馨琢,等. 产ESBLs大肠埃希菌氨基糖苷类抗菌药耐药性及修饰酶基因的研究[J]. 重庆医学,2010,39(15):1984-1950.
15	吴蓉,张隆,戴俊华,等. 产ESBLs大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素的耐药表型与修饰酶基因研究[J]. 现代检验医学杂志,2010,25(3):31-33.
16	张卓然,夏梦岩,倪语星. 微生物耐药的基础与临床[M]. 北京:人民卫生出版社,2006:149-150.
17	MINGEOT-LECLEREQ MP,GLUPCZYNSKI Y,TULKENS PM.Aminoglycosides:activity and resistance[J]. Antimicrob Agents Chemother,1999,43(4):727-737.

类型	基因名称	引物序列（5'~3'）	产物长度（bp）
AME	aac（3）-Ⅰ	P1：CACCTACTCCCAACATCAGCC	331
		P2：TTCTTCCCGTATGCCCAACT
	aac（3）-Ⅱ	P1：ATGCATACGCGGAAGGCAATAACGG	861
		P2：CTAACCTGAAGGCTCGCAAGAGC
	aac（6′）-Ⅰad	P1：CCAAGATCCACCATTATTAGC	193
		P2：CGTATTCGTCCCTTCAACAT
	aac（6′）-Ⅰb	P1：TGCGATGCTCTATGAGTGGC	358
		P2：GTCCGTTTGGATCTTGGTGA
	aac（6′）-Ⅱ	P1：TGATGGCTGGTGGGAAGATG	191
		P2：AGCGTATGGCTCGATGGTTG
	ant（3″）-Ⅰ	P1：ATCATTCCGTGGCGTTATCC	347
		P2：CAGTCGGCAGCGACATCCTT
	ant（2″）-Ⅰ	P1：ACAACGCAGGTCACATTGATACAC	269
		P2：CACCAAGCAGGTTCGCAGTC
16S rRNA甲基化酶	armA	P1：CGCGGATCCATGGATAAGAATGATGTTGTTAAG	774
		P2：CCGCTCGAGTTATTATTTCTGAAATCCACTAGT
	rmtA	P1：CGCGGATCCATGAGCTTTGACGATGCCCTAGCGT	769
		P2：CCGCTCGAGTTATCACTTATTCCTTTTTATCATGTA
	rmtB	P1：CGCGGATCCATGAACATCAACGATGCCCTCACCT	756
		P2：CCGCTCGAGTTATCCATTCTTTTTTATCAAGTA
	rmtC	P1：CGCGGATCCATGAAAACCAACGATAATTAT	846
		P2：CCGCTCGAGTTACAATCTCGATACGATAAAATAC
	rmtD	P1：CGCGGATCCATGAGCGAACTGAAGGAAAAACTGCT	744
		P2：CCGCTCGAGTCATTTTCGTTTCAGCACGTAAACAG
	npmA	P1：CGCGGATCCATGTTAATACTCAAAGGAACAAAGAC	660
		P2：CCGCTCGAGTTAATGTTTTGAAACATGGCCAG

类型	基因名称	引物序列（5'~3'）	产物长度（bp）
AME	aac（3）-Ⅰ	P1：CACCTACTCCCAACATCAGCC	331
		P2：TTCTTCCCGTATGCCCAACT
	aac（3）-Ⅱ	P1：ATGCATACGCGGAAGGCAATAACGG	861
		P2：CTAACCTGAAGGCTCGCAAGAGC
	aac（6′）-Ⅰad	P1：CCAAGATCCACCATTATTAGC	193
		P2：CGTATTCGTCCCTTCAACAT
	aac（6′）-Ⅰb	P1：TGCGATGCTCTATGAGTGGC	358
		P2：GTCCGTTTGGATCTTGGTGA
	aac（6′）-Ⅱ	P1：TGATGGCTGGTGGGAAGATG	191
		P2：AGCGTATGGCTCGATGGTTG
	ant（3″）-Ⅰ	P1：ATCATTCCGTGGCGTTATCC	347
		P2：CAGTCGGCAGCGACATCCTT
	ant（2″）-Ⅰ	P1：ACAACGCAGGTCACATTGATACAC	269
		P2：CACCAAGCAGGTTCGCAGTC
16S rRNA甲基化酶	armA	P1：CGCGGATCCATGGATAAGAATGATGTTGTTAAG	774
		P2：CCGCTCGAGTTATTATTTCTGAAATCCACTAGT
	rmtA	P1：CGCGGATCCATGAGCTTTGACGATGCCCTAGCGT	769
		P2：CCGCTCGAGTTATCACTTATTCCTTTTTATCATGTA
	rmtB	P1：CGCGGATCCATGAACATCAACGATGCCCTCACCT	756
		P2：CCGCTCGAGTTATCCATTCTTTTTTATCAAGTA
	rmtC	P1：CGCGGATCCATGAAAACCAACGATAATTAT	846
		P2：CCGCTCGAGTTACAATCTCGATACGATAAAATAC
	rmtD	P1：CGCGGATCCATGAGCGAACTGAAGGAAAAACTGCT	744
		P2：CCGCTCGAGTCATTTTCGTTTCAGCACGTAAACAG
	npmA	P1：CGCGGATCCATGTTAATACTCAAAGGAACAAAGAC	660
		P2：CCGCTCGAGTTAATGTTTTGAAACATGGCCAG

抗菌药物	产ESBLs大肠埃希菌（32株）			不产ESBLs大肠埃希菌（8株）
抗菌药物	敏感	中介	耐药	敏感	中介	耐药
庆大霉素	0（0）	0（0）	32（100）	8（100）	0（0）	0（0）
阿米卡星	32（100）	0（0）	0（0）	8（100）	0（0）	0（0）
妥布霉素	0（0）	4（13）	28（87）	8（100）	0（0）	0（0）
奈替米星	27（85）	5（15）	0（0）	8（100）	0（0）	0（0）
卡那霉素	0（0）	26（82）	6（18）	8（100）	0（0）	0（0）

抗菌药物	产ESBLs大肠埃希菌（32株）			不产ESBLs大肠埃希菌（8株）
抗菌药物	敏感	中介	耐药	敏感	中介	耐药
庆大霉素	0（0）	0（0）	32（100）	8（100）	0（0）	0（0）
阿米卡星	32（100）	0（0）	0（0）	8（100）	0（0）	0（0）
妥布霉素	0（0）	4（13）	28（87）	8（100）	0（0）	0（0）
奈替米星	27（85）	5（15）	0（0）	8（100）	0（0）	0（0）
卡那霉素	0（0）	26（82）	6（18）	8（100）	0（0）	0（0）

基因名称	阳性株数	阳性率（%）
aac（3）-Ⅱ	32	100.0
aac（6'）-Ⅰb	3	9.4
ant（3"）-Ⅰ	2	6.2
ant（2"）-Ⅰ	1	3.1
aac（3）-Ⅱ+aac（6'）-Ⅰb	3	12.5
aac（3）-Ⅱ+ant（3"）-Ⅰ	2	6.2
aac（3）-Ⅱ+ant（2"）-Ⅰ	1	3.1