Polymyxin NP实验筛查肠杆菌科多黏菌素耐药菌株临床评价

doi:10.3969/j.issn.1673-8640.2020.10.007

摘要/Abstract

摘要：

目的评价Polymyxin NP实验筛查多黏菌素耐药肠杆菌科细菌的临床价值。方法采用Polymyxin NP实验对461株肠杆菌科临床分离株进行初步筛查,采用微量肉汤稀释法测定菌株对多黏菌素的最小抑菌浓度（MIC）,采用纸片扩散法进行临床常用抗菌药物的体外药物敏感性试验,采用聚合酶链反应（PCR）扩增多黏菌素耐药相关基因pmrA、pmrB、phoP、phoQ、mgrB和mcr,并进行测序,采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测多黏菌素耐药相关双组分调控元件pmrA/pmrB、pmrD/pmrF、PhoP/PhoQ表达水平。结果 461株肠杆菌科细菌中,13株多黏菌素耐药株Polymyxin NP实验在2 h内均表现为阳性,多黏菌素敏感菌株表现为阴性。13株多黏菌素耐药菌株中,10株肺炎克雷伯菌主要由mgrB基因插入突变及双组分调控系统pmrA/pmrB和PhoP/PhoQ突变或表达上调引起,1株大肠埃希菌由质粒携带的mcr-1基因介导,2株阴沟肠杆菌的耐药机制尚不清楚。多黏菌素耐药菌株和敏感菌株对多种常用抗菌药物的耐药率差异无统计学意义（P>0.05）。结论 Polymyxin NP实验操作简便、结果可靠,可用于各种机制介导的多黏菌素耐药肠杆菌科细菌的临床筛查,为临床抗感染治疗和耐药防控提供依据。

关键词: 肠杆菌科, Polymyxin NP实验, 多黏菌素耐药

Abstract:

Objective To evaluate the clinical role of Polymyxin NP test for screening polymyxin-resistant Enterobacteriaceae. Methods A total of 461 isolates of Enterobacteriaceae were screened by Polymyxin NP test preliminarily. Broth microdilution method was performed to determine minimum inhibitory concentration（MIC） of polymyxin,and Kirby-Bauer method was used to determine the in vitro antimicrobial susceptibility of common antibiotics. Polymyxin-related genes,including pmrA,pmrB,phoP,phoQ,mgrB and mcr,were determined by polymerase chain reaction（PCR） and sequencing. Real-time quantitative polymerase chain reaction（qRT-PCR） was performed to determine the expression levels of genes associated with pmrA/pmrB,pmrD/pmrF and PhoP/PhoQ regulatory systems. Results Among the 461 Enterobacteriaceae isolates,within 2 h,13 polymyxin-resistant isolates were positive in Polymyxin NP test,and polymyxin-susceptible isolates were negative. Totally,10 of 13 polymyxin-resistant isolates belonging to Klebsiella pneumoniae resulted from insertion of mgrB as well as mutants and expression increasing of pmrA/pmrB and PhoP/PhoQ regulatory systems,and 1 isolate belonging to Escherichia coli was mediated bymcr-1 in plasmid. The resistance mechanisms of 2 isolates of Enterobacter cloacae were still unclear. There was no statistical significance between polymyxin-resistant and polymyxin-susceptible isolates（P>0.05）. Conclusions Polymyxin NP test is easy to perform and reliable. It could be used in screening polymyxin-resistant Enterobacteriaceae mediated by various mechanisms,which can provide a reference for treating infectious diseases and preventing the prevalence of resistance.

Key words: Enterobacteriaceae, Polymyxin NP test, Polymyxin resistance

中图分类号:

R446.5

唐瑜, 沈平华, 史保庆, 蒋晓飞. Polymyxin NP实验筛查肠杆菌科多黏菌素耐药菌株临床评价[J]. 检验医学, 2020, 35(10): 994-999.

TANG Yu, SHEN Pinghua, SHI Baoqing, JIANG Xiaofei. Clinical evaluation of Polymyxin NP test for screening polymyxin-resistant Enterobacteriaceae[J]. Laboratory Medicine, 2020, 35(10): 994-999.

图/表 6

参考文献 18

[1]	MORRILL H J,POGUE J M,KAYE K S,et al. Treatment options for carbapenem-resistant Enterobacteriaceae infections[J]. Open Forum Infect Dis,2015,2(2):of v50.
[2]	LEE S Y,SHIN J H,LEE K,et al.Comparison of the Vitek 2,MicroScan,and Etest methods with the agar dilution method in assessing colistin susceptibility of bloodstream isolates of Acinetobacter species from a Korean university hospital[J]. J Clin Microbiol,2013,51(6):1924-1926.
[3]	MALHOTRA-KUMAR S,XAVIER B B,DAS A J,et al.Colistin resistance gene mcr-1 harboured on a multidrug resistant plasmid[J]. Lancet Infect Dis,2016,16(3):283-284.
[4]	MULVEY M R,MATASEJE L F,ROBERTSON J,et al.Dissemination of the mcr-1 colistin resistance gene[J]. Lancet Infect Dis,2016,16(3):289-290.
[5]	LIU Y,WANG Y,WALSH T R,et al.Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China:a microbiological and molecular biological study[J]. Lancet Infect Dis,2016,16(2):161-168.
[6]	NORDMANN P,JAYOL A,POIREL L.Rapid detection of polymyxin resistance in Enterobacteriaceae[J]. Emerg Infect Dis,2016,22(6):1038-1043.
[7]	European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters,version 6.0[S]. Sweden:European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing,2016.
[8]	Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[S]. M100-S26,CLSI,2016.
[9]	JAYOL A,NORDMANN P,BRINK A,et al.Heteroresistance to colistin in Klebsiella pneumoniae associated with alterations in the PhoPQ regulatory system[J]. Antimicrob Agents Chemother,2015,59(5):2780-2784.
[10]	GUPTA N,LIMBAGO B M,PATEL J B,et al.Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae:epidemiology and prevention[J]. Clin Infect Dis,2011,53(1):60-67.
[11]	NORDMANN P,NAAS T,POIREL L.Global spread of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae[J]. Emerg Infect Dis,2011,17(10):1791-1798.
[12]	SRINIVAS P,RIVARD K.Polymyxin resistance in gram-negative pathogens[J]. Curr Infect Dis Rep,2017,19(11):38.
[13]	KAYE K S,POGUE J M,TRAN T B,et al.Agents of last resort:polymyxin resistance[J]. Infect Dis Clin North Am,2016,30(2):391-414.
[14]	NANG S C,LI J,VELKOV T.The rise and spread of mcr plasmid-mediated polymyxin resistance[J]. Crit Rev Microbiol,2019,45(2):131-161.
[15]	YU Z,QIN W,LIN J,et al.Antibacterial mechanisms of polymyxin and bacterial resistance[J]. Biomed Res Int,2015,2015:679109.
[16]	YU H,QU F,SHAN B,et al.Detection of the mcr-1 colistin resistance gene in carbapenem-resistant Enterobacteriaceae from different hospitals in China[J]. Antimicrob Agents Chemother,2016,60(8):5033-5035.
[17]	JAYOL A,POIREL L,BRINK A,et al.Resistance to colistin associated with a single amino acid change in protein PmrB among Klebsiella pneumoniae isolates of worldwide origin[J]. Antimicrob Agents Chemother,2014,58(8):4762-4766.
[18]	GIRARDELLO R,VISCONDE M,CAYÔ R,et al.Diversity of polymyxin resistance mechanisms among Acinetobacter baumannii clinical isolates[J]. Diagn Microbiol Infect Dis,2017,87(1):37-44.

引物名称	引物序列（5'~3'）	产物大小/bp
mcr-1-F	CGGTCAGTCCGTTTGTTC	1 651
mcr-1-R	CCCACCGCCCATAATAC
mcr-2-F	ATGACATCACATCACTCTTGG	1 617
mcr-2-R	TTACTGGATAAATGCCGCGC
mcr-3-F	TTGGCACTGTATTTTGCATTT	542
mcr-3-R	TTAACGAAATTGGCTGGAACA
mcr-4-F	ATTGGGATAGTCGCCTTTTT	487
mcr-4-R	TTACAGCCAGAATCATTATCA

引物名称	引物序列（5'~3'）	产物大小/bp
mcr-1-F	CGGTCAGTCCGTTTGTTC	1 651
mcr-1-R	CCCACCGCCCATAATAC
mcr-2-F	ATGACATCACATCACTCTTGG	1 617
mcr-2-R	TTACTGGATAAATGCCGCGC
mcr-3-F	TTGGCACTGTATTTTGCATTT	542
mcr-3-R	TTAACGAAATTGGCTGGAACA
mcr-4-F	ATTGGGATAGTCGCCTTTTT	487
mcr-4-R	TTACAGCCAGAATCATTATCA

菌株	细菌种类	样本类型	Polymyxin NP 实验结果	多黏菌素耐药性	MIC/ （μg/mL）
菌株	细菌种类	样本类型	Polymyxin NP 实验结果	多黏菌素耐药性	多黏菌素E	多黏菌素B
ECL1207	阴沟肠杆菌	痰液	+	耐药	>32	>32
ECL1385	阴沟肠杆菌	痰液	+	耐药	32	32
ECO1500	大肠埃希菌	尿液	+	耐药	16	8
KP199	肺炎克雷伯菌	尿液	+	耐药	32	8
KP215	肺炎克雷伯菌	痰液	+	耐药	8	16
KP1036	肺炎克雷伯菌	血液	+	耐药	8	>32
KP1202	肺炎克雷伯菌	脑脊液	+	耐药	>32	>32
KP1292	肺炎克雷伯菌	痰液	+	耐药	>32	32
KP1324	肺炎克雷伯菌	尿液	+	耐药	16	8
KP340	肺炎克雷伯菌	尿液	+	耐药	16	8
KP1305	肺炎克雷伯菌	尿液	+	耐药	>32	32
KP1542	肺炎克雷伯菌	尿液	+	耐药	>32	>32
KP1543	肺炎克雷伯菌	尿液	+	耐药	>32	>32

菌株	细菌种类	样本类型	Polymyxin NP 实验结果	多黏菌素耐药性	MIC/ （μg/mL）
菌株	细菌种类	样本类型	Polymyxin NP 实验结果	多黏菌素耐药性	多黏菌素E	多黏菌素B
ECL1207	阴沟肠杆菌	痰液	+	耐药	>32	>32
ECL1385	阴沟肠杆菌	痰液	+	耐药	32	32
ECO1500	大肠埃希菌	尿液	+	耐药	16	8
KP199	肺炎克雷伯菌	尿液	+	耐药	32	8
KP215	肺炎克雷伯菌	痰液	+	耐药	8	16
KP1036	肺炎克雷伯菌	血液	+	耐药	8	>32
KP1202	肺炎克雷伯菌	脑脊液	+	耐药	>32	>32
KP1292	肺炎克雷伯菌	痰液	+	耐药	>32	32
KP1324	肺炎克雷伯菌	尿液	+	耐药	16	8
KP340	肺炎克雷伯菌	尿液	+	耐药	16	8
KP1305	肺炎克雷伯菌	尿液	+	耐药	>32	32
KP1542	肺炎克雷伯菌	尿液	+	耐药	>32	>32
KP1543	肺炎克雷伯菌	尿液	+	耐药	>32	>32

组别	株数	阿米卡星	庆大霉素	头孢唑啉	头孢呋辛	头孢噻肟	头孢美唑	头孢他啶
多黏菌素敏感组	448	223 （49.78）	293 （65.40）	354 （79.02）	348 （77.68）	346 （77.23）	250 （55.80）	299 （66.74）
多黏菌素耐药组	13	6 （46.15）	10 （76.92）	11 （84.62）	12 （92.31）	11 （84.62）	9 （69.23）	10（76.92）
合计	461	229（49.67）	303（65.73）	365 （79.18）	360 （78.09）	357（77.44）	259（56.18）	309（67.03）
组别	头孢吡肟	环丙沙星	哌拉西林	哌拉西林/他唑巴坦	复方磺胺甲噁唑	亚胺培南	美罗培南	替加环素^*
多黏菌素敏感组	325 （72.54）	351 （78.35）	391 （87.28）	252 （56.25）	249 （55.58）	238 （53.13）	240 （53.57）	31 （6.92）
多黏菌素耐药组	9 （69.23）	10 （76.92）	11 （84.62）	10 （76.92）	7 （53.85）	9 （69.23）	9 （69.23）	2 （15.38）
合计	334 （72.45）	361 （78.31）	402 （87.20）	262 （56.83）	256 （55.53）	247 （53.58）	249 （54.01）	33 （7.16）