高通量检测戈谢病和尼曼匹克病A/B型的超高效液相色谱-串联质谱法的建立

doi:10.3969/j.issn.1673-8640.2016.06.017

检验医学 ›› 2016, Vol. 31 ›› Issue (6): 521-526.DOI: 10.3969/j.issn.1673-8640.2016.06.017

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高通量检测戈谢病和尼曼匹克病A/B型的超高效液相色谱-串联质谱法的建立

占霞, 顾学范, 琳娜, 叶军, 邱文娟, 韩连书, 张惠文, 梁黎黎

上海交通大学医学院附属新华医院上海市儿科医学研究所小儿内分泌、遗传代谢病研究室,上海 200092

收稿日期:2015-09-08 出版日期:2016-06-30 发布日期:2016-07-05
作者简介:null
作者简介：占霞,女,1987年生,硕士,技师,主要从事新生儿疾病筛查和研究工作。

通讯作者：顾学范,联系电话：021-25076458。
基金资助:
“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAI09B04）;上海市科学技术委员会重大课题（11dz1950300）

Establishment of ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the high-throughput determinations for Gaucher disease and Niemann-Pick disease type

A/B ZHAN Xia, GU Xuefan, LIN Na, YE Jun, QIU Wenjuan, HAN Lianshu, ZHANG Huiwen, LIANG Lili

Department of Pediatric Endocrinology and Genetic Metabolism,Shanghai Institute for Pediatric Research,Xinhua Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200092,China

Received:2015-09-08 Online:2016-06-30 Published:2016-07-05

摘要/Abstract

摘要：

目的建立超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）技术测定干血滤纸片中酸性葡萄糖脑苷脂酶（ABG）和酸性鞘磷脂酶（ASM）活性的方法。方法将干血滤纸片样本提取液与酶作用底物和内标的混合溶液孵育过夜,反应液经萃取、氮气吹干及复溶后采用UPLC-MS/MS检测产物浓度及内标,计算酶活性。评价该方法的线性、精密度和准确性。结果 UPLC-MS/MS测定ABG和ASM活性的批内、批间精密度为3.6%~8.4%,批内、批间准确度为101%~115%。正常新生儿中ABG和ASM活性呈偏态分布（P<0.01）,以第0.5~99.5百分位数法确定ABG及ASM活性的参考区间分别为5.52~49.50和2.02~15.44 μmol·L^-1·h^-1。经临床验证,UPLC-MS/MS能有效检出戈谢病（GD）或尼曼匹克病A/B型（NPA/B）患儿,检出率为100%。结论 UPLC-MS/MS能同时测定干血滤纸片中ABG、ASM活性。该法快速、特异,可用于新生儿中GD、NPA/B的高通量筛查及临床检测。

关键词: 酸性葡萄糖脑苷脂酶, 酸性鞘磷脂酶, 串联质谱, 干血滤纸片

Abstract:

Objective To establish a method for the determination of the activities of acid-beta-glucocerebrosidase （ABG）and acid sphingomyelinase （ASM） in dried blood spot specimens by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）. Methods The extraction of dried blood spot specimens was incubated with enzyme substrates and internal standards overnight,and the reaction solution was extracted,dried under nitrogen and reconstituted. The concentrations and internal standards were analyzed by UPLC-MS/MS,and the activities of enzymes were calculated. Linearity,precision and accuracy were analyzed. Results The within-run and between-run precisions for ABG and ASM activities were 3.6%-8.4%,and the within-run and between-run accuracies were 101%-115%. ABG and ASM activities of healthy newborns showed a skewed distribution（P<0.01）. The reference intervals for ABG and ASM activities were 5.52-49.50 and 2.02-15.44 μmol·L^-1·h^-1 according to 0.5th-99.5th percentiles. After judgement,the determination rate for Gaucher disease（GD）or Niemann-Pick disease type A/B （NPA/B）patient was 100%. Conclusions UPLC-MS/MS can determine ABG and ASM activities in dried blood spot specimens simultaneously,and it is rapid and specific,which could be applied in newborn screening of high-throughput determinations for GD and NPA/B.

Key words: Acid-beta-glucocerebrosidase, Acid sphingomyelinase, Tandem mass spectrometry, Dried blood spot

中图分类号:

R446.5

占霞, 顾学范, 琳娜, 叶军, 邱文娟, 韩连书, 张惠文, 梁黎黎. 高通量检测戈谢病和尼曼匹克病A/B型的超高效液相色谱-串联质谱法的建立[J]. 检验医学, 2016, 31(6): 521-526.

A/B ZHAN Xia, GU Xuefan, LIN Na, YE Jun, QIU Wenjuan, HAN Lianshu, ZHANG Huiwen, LIANG Lili. Establishment of ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the high-throughput determinations for Gaucher disease and Niemann-Pick disease type[J]. Laboratory Medicine, 2016, 31(6): 521-526.

图/表 6

参考文献 14

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化合物	离子对（m/z）	锥孔电压（V）	碰撞电压（V）
ABG产物	482.5→264.3	18	22
ASM产物	398.4→264.3	16	20
ABG内标	510.5→264.3	20	26
ASM内标	370.4→264.3	14	18

化合物	离子对（m/z）	锥孔电压（V）	碰撞电压（V）
ABG产物	482.5→264.3	18	22
ASM产物	398.4→264.3	16	20
ABG内标	510.5→264.3	20	26
ASM内标	370.4→264.3	14	18

项目	线性回归方程	r值
ABG	Y=0.880X+0.007 23	0.999 0
ASM	Y=1.272X+0.000 884	0.999 9

项目	线性回归方程	r值
ABG	Y=0.880X+0.007 23	0.999 0
ASM	Y=1.272X+0.000 884	0.999 9

组别	例数	项目	UPLC-MS/MS（µmol·L^-1·h^-1）		白细胞酶学
组别	例数	项目	参考区间	均值（范围）	参考区间	酶活性均值
GD组	5	ABG	5.52~49.50	0.37（0.09~0.78）	6.56~55.10 nmol·h^-1·mg^-1	1.90 nmol·h^-1·mg^-1
NPA/B组	5	ASM	2.02~15.44	0.41（0.23~0.78）	12.02~114.50 nmol·17 h^-1·mg^-1	3.37 nmol·17 h^-1·mg^-1

高通量检测戈谢病和尼曼匹克病A/B型的超高效液相色谱-串联质谱法的建立

Establishment of ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the high-throughput determinations for Gaucher disease and Niemann-Pick disease type

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