罕见病实验室诊断技术的进展

doi:10.3969/j.issn.1673-8640.2021.02.002

摘要/Abstract

摘要：

罕见病是一类单病种发病率很低、病情严重、进展迅速的疾病,对其早期诊断能够有效延缓病程,提高患儿生存质量。随着高通量测序技术的普及、第3代测序技术的逐步完善以及多组学研究技术的进步,罕见病的实验室诊断方法不断多样化、高效化,通过整合高速更新的大数据,选择性结合细胞遗传学及分子遗传学方法,同时灵活运用生化检测指标等,将有效支持和推动罕见病的诊断进程。检测技术的进步使罕见病的诊断水平有了极大的提升,而对罕见病实验室诊断技术的全面认识将有助于其在临床应用中充分发挥优势。文章就现有的罕见病实验室诊断技术及其进展作一综述,以期能提高临床对不同诊断技术的认识,帮助临床选择合适的检测方法。

关键词: 罕见病, 实验室诊断技术, 细胞遗传学, 分子遗传学, 高通量测序

Abstract:

Rare diseases are a series of single disease with a low incidence severe condition,and rapid progress. Early diagnosis can effectively delay the course of disease and improve the quality of life of patients. With the popularization of high-throughput sequencing,gradual improvement of third-generation sequencing technique and advances in multiomics research technique,laboratory diagnostic methods for rare diseases have continued to diversify and become more efficient. The integration of high-speed updated big data,selective combination of cytogenetics and molecular genetics methods,and flexible use of biochemical detection indicators will effectively support and promote the diagnosis of rare diseases. Technological progress has greatly improved the diagnostic level of rare diseases,and a comprehensive understanding of laboratory diagnostic techniques for rare diseases will help to give full play to its advantages in clinical applications. In this article,we reviewed the existing laboratory diagnostic techniques for rare diseases and their progress in order to improve clinical understanding of different diagnostic techniques and help to choose suitable testing methods.

Key words: Rare diseases, Laboratory diagnostic techniques, Cytogenetics, Molecular genetics, High-throughput sequencing

中图分类号:

R596

张仪, 王增阁, 王剑. 罕见病实验室诊断技术的进展[J]. 检验医学, 2021, 36(2): 122-129.

ZHANG Yi, WANG Zengge, WANG Jian. Progress in laboratory diagnosis of rare diseases[J]. Laboratory Medicine, 2021, 36(2): 122-129.

图/表 1

参考文献 44

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名称	原理	适用范围	优点	缺点
细胞遗传学技术
染色体核型分析	根据分裂中期染色体长度、臂比、着丝点位置及有无随体等,借助显带技术进行分析、比较、排序、编号,依据染色体结构与数目异常诊断疾病	染色体数目和结构变异,包括平衡和不平衡易位、倒位等	操作简便,结果直观,适用于染色体大范围结构异常分析	材料受限,需活细胞培养,分辨率低,实验周期长,不能检测杂合性缺失和单亲二倍体
FISH	荧光标记的探针与待测样本的核酸序列按碱基互补配对原则原位杂交后镜下观察	靶向分析染色体数目,染色体（质）空间结构,研究染色质结构变异,包括易位、缺失、重复等	经济安全,简便易行,无需细胞培养,实验周期短,定位准确,灵敏度及特异性高,分辨率高于染色体核型分析	检测位点有限,步骤繁多,易造成假阴性,只能定性,不能定量,无法检测背景未知的遗传病,不能检测杂合性缺失和单亲二倍体
CMA	将等量待测DNA和正常对照DNA分别用不同荧光染料标记混合,与全基因组DNA芯片进行竞争性杂交,经激光扫描,比较发光强度分析待测样本拷贝数	染色体数目异常及微缺失、微重复	准确测定和定位微缺失及微重复的大小,无需细胞培养,可鉴定杂合性缺失及单亲二倍体,分辨率高于染色核型分析和FISH	不能检测染色体平衡易位、点突变及串联重复序列扩增所致遗传病、三倍体以上的多倍体,易产生临床意义不明的拷贝数变异
单分子光学图谱技术	通过内切酶对基因组DNA进行原位切割并标记荧光,经超长单分子高分辨率荧光成像生成酶切位点分布图	分析高复杂区重复序列和基因组结构变异	可提供全基因组范围内的结构变异及其顺序,可检测倒位和平衡易位等大小为kb级别的平衡变异,具有很高的灵敏度	不能检测出微小片段的缺失或插入,样本处理、检测及数据分析流程尚待优化
分子遗传学技术
PCR相关技术	对特定DNA分子进行指数级扩增	基因位点分型、拷贝数变异检测等	特异性强,灵敏度高,简便快速,纯度要求低	通量有限
第1代测序	双脱氧链终止法	临床上诊断较明确的单基因疾病,高通量测序结果的验证	高度准确,快速便捷,分辨率高,测序长度高于NGS,单个反应,成本低	测序通量低,获得大量序列的成本很高,不适用于没有明确候选基因或候选基因数量较多的情况
NGS	边合成边测序法或连接酶法	临床诊断困难的罕见病	通量高,精度高,数据丰富,单条序列成本低	测序读长短,数据分析专业性强,数据量大,存储不便,无法检测三碱基重复疾病,难以区分同源基因
第3代测序	单分子测序法	临床诊断困难的罕见病	无需PCR扩增即可对单个DNA分子进行测序,超长读长	错误率较高
MLPA	针对目标基因设计多对杂交探针,经杂交连接等反应后,将目标基因的拷贝数等比例转化为可供扩增的杂交探针的数目,对DNA进行定性分析和相对定量分析	检测人类基因组序列中的非整倍体异常、微缺失和微重复,识别DNA甲基化状态,检测单核苷酸多态性和点突变,量化mRNA	操作简便、灵敏度高、特异性强、重复性好	无法检测低水平嵌合、女性三倍体和平衡染色体异常,如倒位和易位等
名称	原理	适用范围	优点	缺点
转录组学
RNA测序	经高通量测序检测样本中全部RNA的变异和表达水平	诊断某些致病机制涉及特定RNA的罕见病,识别剪接位点变异所致蛋白质转录水平异常导致的罕见病	全基因组水平分析,定量准确,重复性高,检测范围广	RNA易降解,组织样本获得困难,对照获得困难,生物信息学分析要求高
蛋白质组学
色谱分析	色谱法	辅助诊断蛋白质表达水平异常的罕见病	直观,可作为诊断标志物	通量低,不能满足罕见病不断增长的诊断需求
蛋白质芯片	将蛋白质固定于固相载体,捕获能与之特异性结合的待测蛋白,分析蛋白质表达谱	检测某种罕见病可能相关的全部蛋白质水平,帮助诊断	与表型直接相关,结果精确,重复性好	专业性强,尚待推广
质谱	样本分子离子化后,依据不同离子间质荷比的差异分离、确定相对分子质量	检测蛋白质表达水平,辅助诊断罕见病	特异性高,灵敏度好,串联质谱可用于筛查罕见病	专业性强,结果易受干扰
X射线晶体学、核磁共振波谱等	解析蛋白质的三维结构	从蛋白质性质上为罕见病诊断提供依据	与表型直接相关,结果直观	技术难度大
代谢组学
核磁共振波谱/质谱/色谱/色谱-质谱联用技术	定性或定量分析各代谢路径的小分子代谢物	通过代谢产物异常辅助诊断罕见病,尤其是遗传代谢病的筛查	与表型最为相关,直接反映病理生理过程	方法尚待完善
生化检测	通过生化反应定性或定量分析疾病标志物	辅助诊断罕见病,尤其是遗传代谢病	操作简便、快捷,易于推广	标志物的特异性影响结果解读
AI技术	通过机器基于海量数据的学习、建模,使其获得数据分析与图像判读的能力	变异分析与特殊面容识别	基于海量数据,效率高,可减少主观因素影响	对应用场景及操作人员要求高,尚不成熟,仍有较多人工参与

名称	原理	适用范围	优点	缺点
细胞遗传学技术
染色体核型分析	根据分裂中期染色体长度、臂比、着丝点位置及有无随体等,借助显带技术进行分析、比较、排序、编号,依据染色体结构与数目异常诊断疾病	染色体数目和结构变异,包括平衡和不平衡易位、倒位等	操作简便,结果直观,适用于染色体大范围结构异常分析	材料受限,需活细胞培养,分辨率低,实验周期长,不能检测杂合性缺失和单亲二倍体
FISH	荧光标记的探针与待测样本的核酸序列按碱基互补配对原则原位杂交后镜下观察	靶向分析染色体数目,染色体（质）空间结构,研究染色质结构变异,包括易位、缺失、重复等	经济安全,简便易行,无需细胞培养,实验周期短,定位准确,灵敏度及特异性高,分辨率高于染色体核型分析	检测位点有限,步骤繁多,易造成假阴性,只能定性,不能定量,无法检测背景未知的遗传病,不能检测杂合性缺失和单亲二倍体
CMA	将等量待测DNA和正常对照DNA分别用不同荧光染料标记混合,与全基因组DNA芯片进行竞争性杂交,经激光扫描,比较发光强度分析待测样本拷贝数	染色体数目异常及微缺失、微重复	准确测定和定位微缺失及微重复的大小,无需细胞培养,可鉴定杂合性缺失及单亲二倍体,分辨率高于染色核型分析和FISH	不能检测染色体平衡易位、点突变及串联重复序列扩增所致遗传病、三倍体以上的多倍体,易产生临床意义不明的拷贝数变异
单分子光学图谱技术	通过内切酶对基因组DNA进行原位切割并标记荧光,经超长单分子高分辨率荧光成像生成酶切位点分布图	分析高复杂区重复序列和基因组结构变异	可提供全基因组范围内的结构变异及其顺序,可检测倒位和平衡易位等大小为kb级别的平衡变异,具有很高的灵敏度	不能检测出微小片段的缺失或插入,样本处理、检测及数据分析流程尚待优化
分子遗传学技术
PCR相关技术	对特定DNA分子进行指数级扩增	基因位点分型、拷贝数变异检测等	特异性强,灵敏度高,简便快速,纯度要求低	通量有限
第1代测序	双脱氧链终止法	临床上诊断较明确的单基因疾病,高通量测序结果的验证	高度准确,快速便捷,分辨率高,测序长度高于NGS,单个反应,成本低	测序通量低,获得大量序列的成本很高,不适用于没有明确候选基因或候选基因数量较多的情况
NGS	边合成边测序法或连接酶法	临床诊断困难的罕见病	通量高,精度高,数据丰富,单条序列成本低	测序读长短,数据分析专业性强,数据量大,存储不便,无法检测三碱基重复疾病,难以区分同源基因
第3代测序	单分子测序法	临床诊断困难的罕见病	无需PCR扩增即可对单个DNA分子进行测序,超长读长	错误率较高
MLPA	针对目标基因设计多对杂交探针,经杂交连接等反应后,将目标基因的拷贝数等比例转化为可供扩增的杂交探针的数目,对DNA进行定性分析和相对定量分析	检测人类基因组序列中的非整倍体异常、微缺失和微重复,识别DNA甲基化状态,检测单核苷酸多态性和点突变,量化mRNA	操作简便、灵敏度高、特异性强、重复性好	无法检测低水平嵌合、女性三倍体和平衡染色体异常,如倒位和易位等
名称	原理	适用范围	优点	缺点
转录组学
RNA测序	经高通量测序检测样本中全部RNA的变异和表达水平	诊断某些致病机制涉及特定RNA的罕见病,识别剪接位点变异所致蛋白质转录水平异常导致的罕见病	全基因组水平分析,定量准确,重复性高,检测范围广	RNA易降解,组织样本获得困难,对照获得困难,生物信息学分析要求高
蛋白质组学
色谱分析	色谱法	辅助诊断蛋白质表达水平异常的罕见病	直观,可作为诊断标志物	通量低,不能满足罕见病不断增长的诊断需求
蛋白质芯片	将蛋白质固定于固相载体,捕获能与之特异性结合的待测蛋白,分析蛋白质表达谱	检测某种罕见病可能相关的全部蛋白质水平,帮助诊断	与表型直接相关,结果精确,重复性好	专业性强,尚待推广
质谱	样本分子离子化后,依据不同离子间质荷比的差异分离、确定相对分子质量	检测蛋白质表达水平,辅助诊断罕见病	特异性高,灵敏度好,串联质谱可用于筛查罕见病	专业性强,结果易受干扰
X射线晶体学、核磁共振波谱等	解析蛋白质的三维结构	从蛋白质性质上为罕见病诊断提供依据	与表型直接相关,结果直观	技术难度大
代谢组学
核磁共振波谱/质谱/色谱/色谱-质谱联用技术	定性或定量分析各代谢路径的小分子代谢物	通过代谢产物异常辅助诊断罕见病,尤其是遗传代谢病的筛查	与表型最为相关,直接反映病理生理过程	方法尚待完善
生化检测	通过生化反应定性或定量分析疾病标志物	辅助诊断罕见病,尤其是遗传代谢病	操作简便、快捷,易于推广	标志物的特异性影响结果解读
AI技术	通过机器基于海量数据的学习、建模,使其获得数据分析与图像判读的能力	变异分析与特殊面容识别	基于海量数据,效率高,可减少主观因素影响	对应用场景及操作人员要求高,尚不成熟,仍有较多人工参与