艰难梭菌二元毒素A的原核表达及免疫原性分析

doi:10.3969/j.issn.1673-8640.2020.02.015

摘要/Abstract

摘要：

目的构建艰难梭菌二元毒素（Cdt）A的原核表达载体,表达并纯化His-CdtA重组蛋白,分析其免疫原性。方法以RT 027型艰难梭菌为模板,采用聚合酶链反应（PCR）扩增cdtA的全长序列,导入大肠埃希菌BL21感受态细胞,诱导His-CdtA重组蛋白表达,并用纯化后的蛋白免疫小鼠,分析小鼠产生的抗体效价。结果成功构建pET-28b-cdtA原核表达载体,诱导并纯化出高浓度的His-CdtA重组蛋白,免疫小鼠后产生高效价的抗CdtA抗体。结论纯化的His-CdtA重组蛋白免疫小鼠产生了高效价的抗CdtA抗体,为后续制备抗CdtA单克隆抗体及建立CdtA的实验室检测方法学奠定了基础。

关键词: 艰难梭菌, 二元毒素A, 原核表达, 抗体, 免疫原性

Abstract:

Objective To construct a prokaryotic expression vector of Clostridium difficile binary toxin（Cdt） A,to express and purify His-CdtA recombinant protein,and to analyze its immunogenicity. Methods The full-length sequence of cdtA was amplified by polymerase chain reaction（PCR） using RT 027 Clostridium difficile as template,which was introduced into Escherichia coli BL21 competent cells. The His-CdtA recombinant protein was induced,and the mice were immunized with the purified protein for analyzing the antibodies produced by the mice. Results The prokaryotic expression vector pET-28b-cdtA was successfully constructed,and a high concentration of His-CdtA recombinant protein was induced and purified. After immunizing mice,high-titer antibody of CdtA recombinant protein was produced. Conclusions The mice immunized with the purified His-CdtA recombinant protein produce high-titer anti-CdtA antibodies,which lay a foundation for the subsequent preparation of monoclonal antibodies against CdtA and the methodology of CdtA laboratory detection.

Key words: Clostridium difficile, Binary toxin A, Prokaryotic expression, Antibody, Immunogenicity

中图分类号:

R446.1

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图/表 7

图1 cdtA PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图注:M为250 bp DNA梯度;1、2为cdtA PCR产物;3为阴性对照

图2 菌液PCR鉴定pET-28b-cdtA的琼脂糖凝胶电泳图注:M为250 bp DNA梯度;1~23分别为23个单菌落的PCR产物;24为阴性对照

图3 诱导pET-28b-CdtA蛋白表达产物的SDS-PAGE图注:M为相对分子质量标准marker;1为未经IPTG诱导的重组菌破碎产物上清;2为未经IPTG诱导的重组菌破碎产物沉淀;3为经0.5 mmol/L IPTG诱导的重组菌破碎产物上清;4为经0.5 mmol/L IPTG诱导的重组菌破碎产物沉淀;5为经1.0 mmol/L IPTG 诱导的重组菌破碎产物上清;6为经1.0 mmol/L IPTG 诱导的重组菌破碎产物沉淀;7为经1.5 mmol/L IPTG 诱导的重组菌破碎产物上清;8为经1.5 mmol/L IPTG 诱导的重组菌破碎产物沉淀;9为pET-28b未经IPTG诱导的菌体总破碎产物

图4 镍柱亲和层析纯化产物的SDS-PAGE图注:M为相对分子质量marker;1为未纯化的重组菌表达蛋白产物上清;2为上柱后穿透液;3~7分别为咪唑浓度为10、50、100、200、300 mmol/L的洗脱液

图5 重组菌与空白载体的表达蛋白纯化产物的SDS-PAGE图注:M为相对分子质量marker;1为重组菌表达蛋白的纯化产物;2为pET-28b表达蛋白的纯化产物

表1 His-CdtA重组蛋白的抗体滴度分析

组别	1∶10²	1∶10³	1∶10⁴	1∶10⁵
CdtA组	+++	+++	+	-
对照组	-	-	-	-

图6 His-CdtA重组蛋白的Western Blot鉴定结果注:M为预染的蛋白梯度; 1、3为纯化后的CdtA重组蛋白; 2、4为阴性对照

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