16通道无标记型糖化血红蛋白检测免疫传感器的构建

doi:10.3969/j.issn.1673-8640.2019.09.015

摘要/Abstract

摘要：

目的构建1种检测糖化血红蛋白（HbA_1c）的无标记电化学免疫传感器。方法通过HbA_1c抗体修饰16通道丝网印刷碳电极（16-SPCE）,制备特异检测HbA_1c的无标记电化学免疫传感器。采用循环伏安法测定16-SPCE电化学免疫传感器检测HbA_1c的电信号,优化检测条件（HbA_1c抗体最佳包被浓度、HbA_1c抗原最佳孵育时间、电极的电化学特性、不同修饰电极的性能）,同时进行初步方法学评价。结果 HbA_1c抗体最佳包被浓度为50 μg/mL,HbA_1c抗原最佳孵育时间为60 min。构建的16-SPCE电化学免疫传感器检测HbA_1c的线性范围为1~50 μg/mL,线性方程为Y=0.199X+10.468（r=0.955）,检测限为0.88 μg/mL。50 μg/mL牛血清白蛋白（BSA）、50 μg/mL前列腺特异性抗原（PSA）和50 μg/mL葡萄糖对16-SPCE电化学免疫传感器检测HbA_1c无干扰。制备的免疫电极在4 ℃能稳定放置5 d。采用16-SPCE电化学免疫传感器检测模拟血清样本中的HbA_1c,各浓度的电流响应值能明显区分,且检测结果的重复性较好。结论构建的16-SPCE电化学免疫传感器具有良好的电化学响应能力、线性范围、抗干扰能力等。

关键词: 糖化血红蛋白, 16 通道丝网印刷碳电极, 电化学免疫传感器

Abstract:

Objective To construct a label-free electrochemical immunosensor for the specific detection of glycated hemoglobin A_1c（HbA_1c）. Methods A 16 channel screen-printed carbon electrode（16-SPCE） was modified by HbA_1c antibody to prepare a label-free electrochemical immunosensor for the specific detection of HbA_1c. Cyclic voltammetry was used to detect the electrical signal of HbA_1c by 16-SPCE electrochemical immunosensor,and the detection conditions（the optimal coating concentration of HbA_1c antibody,the optimal incubation time of HbA_1c antigen,the electrochemical characteristics of the electrode and the performance of different modified electrodes） were optimized. A preliminary methodological evaluation was conducted. Results The optimal HbA_1c antibody coating concentration was 50 μg/mL,and the optimal HbA_1c antigen incubation time was 60 min. The linear range of HbA_1c was 1-50 μg/mL,and the linear equation was Y=0.199X+10.468（r=0.955）. The detection limit was 0.88 μg/mL,and 50 μg/mL bovine serum albumin（BSA）,50 μg/mL prostate-specific antigen（PSA） and 50 μg/mL glucose did not interfere with the detection of HbA_1c by 16-SPCE electrochemical immunosensor. The prepared immunoelectrode was stably placed at 4 °C for 5 d. The 16-SPCE electrochemical immunosensor was used to detect HbA_1c in the simulated serum samples. The current response values of each concentration were clearly distinguished,and the repeatability was good. Conclusions The constructed 16-SPCE electrochemical immunosensor has good electrochemical response,linear range and anti-interference ability.

Key words: Glycated hemoglobin A_1c, 16 Channel screen-printed carbon electrode, Electrochemical immunosensor

中图分类号:

R446.1

王潇, 宓现强. 16通道无标记型糖化血红蛋白检测免疫传感器的构建[J]. 检验医学, 2019, 34(9): 835-840.

WANG Xiao, MI Xianqiang. Construction of a 16 channel label-free electrochemical immunosensor for glycated hemoglobin A_1c detection[J]. Laboratory Medicine, 2019, 34(9): 835-840.

图/表 11

图1 16-SPCE电化学免疫传感器检测HbA1c的示意图注：（a）HbA1c抗体修饰16-SPCE电化学免疫传感器的结构示意图;（b）电化学免疫传感器检测响应的循环伏安检测示意图

图2 HbA1c抗体的最佳包被浓度注：■固定抗原浓度组（50 μg/mL HbA1c）;□空白对照组（PBS）

图3 HbA1c抗原的最佳孵育时间注：■固定抗原浓度组（50 μg/mL HbA1c）;□空白对照组（PBS）

图4 不同电极的电化学特性注：（a）不同电极在测试底液（1 mmol/L H2O2）中的电化学变化;（b）不同修饰电极在测试底液（1 mmol/L H2O2）中的电流响应值;—裸碳电极;- - HbA1c抗体修饰后的电极;…结合抗原后的电极

图5 不同电极检测HbA1c的性能差异注：——裸碳电极;- - - HbA1c抗体修饰后的电极

图6 16-SPCE电化学免疫传感器对不同浓度HbA1c注：—0 μg/mL;- - 25 μg/mL;… 50 μg/mL

图7 免疫电极电流响应与HbA1c浓度的关系注：（a）16-SPCE电化学免疫传感器检测不同浓度HbA1c抗原的电流响应值;（b）标准曲线

图8 16-SPCE电化学免疫传感器检测HbA1c的干扰实验注：1为5 μg/mL HbA1c;2为5 μg/mL HbA1c+50 μg/mL BSA;3为5 μg/mL HbA1c+50 μg/mL PSA;4为5 μg/mL HbA1c+50 μg/mL 葡萄糖

图9 16-SPCE电化学免疫传感器的稳定性分析注：■固定抗原浓度组（50 μg/mL HbA1c）;□空白对照组（PBS）

图10 16-SPCE电化学免疫传感器检测模拟注：●为HbA1c抗体修饰16-SPCE电化学免疫传感器检测不同浓度HbA1c模拟血清样品的电流响应值

表1 16-SPCE电化学免疫传感器检测模拟临床血清样本中的HbA1c

HbA_1c （μg/mL）	Δ响应电流（μA）
HbA_1c （μg/mL）	第1项检测	第2项检测	第3项检测
0.5	0.74	0.91	0.65
5.0	2.10	1.89	2.02
50.0	3.77	3.61	3.63

[1]	KONG Z,VANROLLEGHEM P A,VERSTRAETE W.An activated sludge-based biosensor for rapid IC50 estimation and on-line toxicity monitoring[J]. Biosens Bioelectron,1993,8(1):49-58.
[2]	KIM D M,SHIM Y B.Disposable amperometric glycated hemoglobin sensor for the finger prick blood test[J]. Anal Chem,2013,85(13):6536-6543.
[3]	ZHANG J D,OYAMA M.A hydrogen peroxide sensor based on the peroxidase activity of hemoglobin immobilized on gold nanoparticles-modified ITO electrode[J]. Electrochimica Acta,2004,50(1):85-90.
[4]	边超,薛茜男,孙楫舟,等. 电位无标型糖化血红蛋白免疫微传感器[J]. 分析化学,2010,38(3):332-336
[5]	边超,屈岚,薛茜男,等. 快速检测糖化血红蛋白的免疫微传感器[J]. 纳米技术与精密工程,2010,8(1):20-24.

[1]	郑志友, 李兴照, 谢雅革. 糖尿病心肌病患者HbA_1c、NT-proBNP、Hcy、SOD和TC水平的变化及其临床意义[J]. 检验医学, 2023, 38(3): 282-286.
[2]	区苑清, 赵凡, 叶爱莲, 李立峰, 赵海桃, 黎惠贞, 梁焯辉, 李粮. 血浆网膜素1水平与2型糖尿病患者代谢清除率的关系[J]. 检验医学, 2022, 37(1): 28-31.
[3]	岳道远, 陈薇, 廖庆, 余微婷, 李辉军. 武汉地区糖化血红蛋白一致性计划的建立和评价[J]. 检验医学, 2022, 37(1): 78-82.
[4]	王微, 王蕾, 王蓓丽, 周芳芳, 胡军, 吴佩, 殷奋, 袁开影, 侯玉敏, 刁端勤, 李国颖, 陈敏, 高雨红. 上海市徐汇区HbA_1c检测一致性计划的建立和初步评价[J]. 检验医学, 2021, 36(5): 549-553.
[5]	康凤凤, 单志明, 宋超, 夏晓华, 陈倩, 郦卫星. 应用西格玛度量和稳健算法评价不同检测系统糖化血红蛋白检测结果的可比性[J]. 检验医学, 2020, 35(2): 168-172.
[6]	李勤, 曾素根, 凌莉琴, 刘超男, 陈思, 杨舒羽, 周静. 2例异常血红蛋白患者HbA_1c测定的分析[J]. 检验医学, 2019, 34(8): 772-774.
[7]	刘文彬, 居漪, 唐立萍, 王美娟, 欧元祝, 虞啸炫, 李卿. 4种糖化血红蛋白检测系统的IFCC二级参考方法认证[J]. 检验医学, 2019, 34(5): 443-446.
[8]	金玥雯, 岳朝艳, 应春妹. 糖化血红蛋白及糖化白蛋白在高龄孕妇妊娠期糖尿病中的应用价值[J]. 检验医学, 2018, 33(4): 312-315.
[9]	唐立萍, 欧元祝, 刘文彬, 虞啸炫. 运用上海地区室间质评结果评价2种糖化血红蛋白POCT分析仪[J]. 检验医学, 2018, 33(3): 248-251.
[10]	钱程, 麻静, 薛明洋, 翟锋, 刘彤. MQ-6000糖化血红蛋白分析仪检测末梢血与静脉全血HbA_1c的比对研究[J]. 检验医学, 2018, 33(10): 928-929.
[11]	逯岭松, 刘蓓, 冷建杭, 马宵. 电化学免疫传感器检测人附睾蛋白4的新方法[J]. 检验医学, 2017, 32(7): 637-641.
[12]	张淳义, 倪颖华, 季鑫, 应春妹. 妊娠期糖尿病患者糖化血红蛋白和糖化白蛋白水平与新生儿体重的相关性[J]. 检验医学, 2017, 32(3): 165-168.
[13]	郭宗辉, 陈永强, 曾方银. 迈瑞H50糖化血红蛋白分析仪精密度和可比性评估[J]. 检验医学, 2017, 32(3): 214-218.
[14]	周松伟, 唐宗青, 张小斌. 健康体检人群糖化血红蛋白与颈动脉内中膜厚度的关系[J]. 检验医学, 2017, 32(12): 1124-1127.
[15]	赵智赟, 袁文华, 宋云霄. 迈瑞H50糖化血红蛋白分析仪性能评价[J]. 检验医学, 2017, 32(12): 1137-1142.