基于二代测序技术的常染色体隐性遗传性多囊肾病家系胚胎植入前遗传学分析

doi:10.3969/j.issn.1673-8640.2022.03.014

检验医学 ›› 2022, Vol. 37 ›› Issue (3): 257-263.DOI: 10.3969/j.issn.1673-8640.2022.03.014

基于二代测序技术的常染色体隐性遗传性多囊肾病家系胚胎植入前遗传学分析

何天文¹, 卢建¹, 陈创奇², 刘顿², 丁红珂¹, 刘玲¹, 杜丽¹, 郑毅春², 尹爱华¹()

1.广东省妇幼保健院医学遗传中心,广东广州 511442
2.广东省妇幼保健院生殖中心,广东广州 511442

收稿日期:2020-09-30 修回日期:2021-12-23 出版日期:2022-03-30 发布日期:2022-05-10
通讯作者: 尹爱华
作者简介:尹爱华,E-mail： yinaiwa@126.com。
何天文,男,1982年生,硕士,副主任技师,主要从事植入前遗传学检测工作。
基金资助:
国家重点研发项目(2016YFC1000703)

Preimplantation genetic testing of infantile polycystic kidney disease by next generation sequencing

HE Tianwen¹, LU Jian¹, CHEN Chuangqi², LIU Dun², DING Hongke¹, LIU Ling¹, DU Li¹, ZHENG Yichun², YIN Aihua¹()

1. Medical Genetics Center,Guangdong Women and Children Hospital,Guangzhou 511442,Guangdong,China
2. Reproductive Center,Guangdong Women and Children Hospital,Guangzhou 511442,Guangdong,China

Received:2020-09-30 Revised:2021-12-23 Online:2022-03-30 Published:2022-05-10
Contact: YIN Aihua

摘要/Abstract

摘要：

目的探讨二代测序（NGS）技术在常染色体隐性遗传性多囊肾病（ARPKD）家系胚胎植入前遗传学检测（PGT）中的应用价值。方法选取1个ARPKD家系,采用Sanger测序调查家系成员多囊肾/多囊肝病变1（PKHD1）基因突变情况。以PKHD1基因编码区为目标区域,在基因上下游2 M区域内选择120个高密度紧密连锁的单核苷酸多态性（SNP）位点作为遗传连锁标记,采用多重聚合酶链反应（PCR）和NGS选择有效SNP位点构建家系成员的SNP单倍型,确定夫妇双方携带基因突变的风险染色体。对活检获得的滋养层细胞进行全基因组扩增,采用NGS对胚胎的PKHD1基因突变位点进行直接测序,构建胚胎SNP单倍型进行连锁分析。采用Sanger测序验证胚胎PKHD1基因突变位点NGS结果。对正常和携带杂合突变的胚胎进行低深度的染色体非整倍性筛查。结果家系成员中,父亲携带PKHD1基因c.5935G>A,为杂合子;母亲携带PKHD1基因c.10058T>G,为杂合子;先证者携带PKHD1基因c.5935G>A和c.10058T>G双重杂合突变。用于活检的5个胚胎中有2个未检测到突变,有3个携带杂合突变。低深度的染色体非整倍性筛查显示5个胚胎中3个为整倍体,2个为非整倍体。选择未检测到突变且发育良好的整倍体胚胎植入母体子宫后,足月分娩一健康婴儿。结论应用NGS对ARPKD家系进行PGT,可阻断此单基因病在该家系中的再发风险,同时还可避免选择非整倍体胚胎而导致的流产问题。

关键词: 多囊肾/多囊肝病变1基因, 常染色体隐性遗传性多囊肾病, 二代测序, 植入前遗传学检测

Abstract:

Objective To investigate the application value of next generation sequencing technology in preimplantation genetic testing（PGT） of autosomal recessive polycystic kidney disease（ARPKD） family. Methods A case of ARPKD family was selected,and the mutation of polycystic kidney and hepatic disease 1（PKHD1） gene in family members was investigated by Sanger sequencing. The coding region of PKHD1 gene was selected as target region,120 high-density closely linked single nucleotide polymorphisms（SNP） were selected as the genetic linkage markers in the upstream and downstream 2 M regions of the gene. The SNP haplotypes of family members were constructed by selecting effective SNP sites by multiplex polymerase chain reaction（PCR） and next generation sequencing,and the risk chromosomes of gene mutation were determined. After the whole genome amplification of the trophoblast cells obtained by blastocyst biopsy,the mutation sites of embryonic PKHD1 gene were sequenced directly,and the embryonic SNP haplotypes were constructed for linkage analysis by next generation sequencing. Sanger sequencing was used to verify the next generation sequencing results of embryonic PKHD1 gene mutation sites. Low depth chromosome aneuploidy screening was carried out both in the normal and the heterozygous embryos. Results The father of the family members carried PKHD1 gene c.5935G>A,which was heterozygous. The mother carries PKHD1 gene c.10058T>G,which was heterozygous. The proband carried double heterozygous mutations of PKHD1 gene c.5935G>A and c.10058T> G. Among the 5 embryos used for biopsy,2 cases were undetected mutations,and 3 cases carried heterozygous mutations. Low depth chromosome aneuploidy screening showed that the 3 of 5 embryos were euploidy,and 2 embryos were aneuploidy. A healthy baby was delivered at full term after a well-developed euploid embryo with no mutation,which was implanted into the mother's uterus. Conclusions The application of next generation sequencing in PGT of ARPKD can block the risk of recurrence of this single gene disease in the family,and avoid the abortion caused by the selection of aneuploid embryos.

Key words: Polycystic kidney and hepatic disease 1 gene, Autosomal recessive polycystic kidney disease, Next generation sequencing, Preimplantation genetic testing

中图分类号:

R446.7

何天文, 卢建, 陈创奇, 刘顿, 丁红珂, 刘玲, 杜丽, 郑毅春, 尹爱华. 基于二代测序技术的常染色体隐性遗传性多囊肾病家系胚胎植入前遗传学分析[J]. 检验医学, 2022, 37(3): 257-263.

HE Tianwen, LU Jian, CHEN Chuangqi, LIU Dun, DING Hongke, LIU Ling, DU Li, ZHENG Yichun, YIN Aihua. Preimplantation genetic testing of infantile polycystic kidney disease by next generation sequencing[J]. Laboratory Medicine, 2022, 37(3): 257-263.

图/表 7

参考文献 17

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样本来源	基因下游		基因内	基因上游
样本来源	1 M~2 M	0 M~1 M	基因内	0 M~1 M	1 M~2 M
父亲	0	1	5	19	0
母亲	6	18	7	11	2

样本来源	基因下游		基因内	基因上游
样本来源	1 M~2 M	0 M~1 M	基因内	0 M~1 M	1 M~2 M
父亲	0	1	5	19	0
母亲	6	18	7	11	2

胚胎编号	c.5935G>A			c.10058T>G
	NGS		Sanger测序	NGS		Sanger测序
	测序深度	读出碱基及数量	Sanger测序	测序深度	读出碱基及数量	Sanger测序
D501	4 200	C（4 200）	C	877	A（877）	A
D502	3 641	C（3 641）	C	1 823	A（1 823）	A
D503	1 548	C（1 073）、 T（475）	C/T	3 074	A（3 074）	A
D504	2 056	C（2 056）	C	2 827	A（1 621）、 C（1 206）	A/C
D505	2 609	C（1 156）、 T（1 453）	C/T	2 395	A（2 395）	A

胚胎编号	c.5935G>A			c.10058T>G
	NGS		Sanger测序	NGS		Sanger测序
	测序深度	读出碱基及数量	Sanger测序	测序深度	读出碱基及数量	Sanger测序
D501	4 200	C（4 200）	C	877	A（877）	A
D502	3 641	C（3 641）	C	1 823	A（1 823）	A
D503	1 548	C（1 073）、 T（475）	C/T	3 074	A（3 074）	A
D504	2 056	C（2 056）	C	2 827	A（1 621）、 C（1 206）	A/C
D505	2 609	C（1 156）、 T（1 453）	C/T	2 395	A（2 395）	A

样本	单倍型检测结果	致病突变检测结果	NGS和Sanger测序		非整倍体筛查	解析
样本	单倍型检测结果	致病突变检测结果	c.5935G>A	c.10058T>G	非整倍体筛查	解析
父亲	M0^①/M1^②	携带	C/T	A
母亲	F0^③/F1^④	携带	C	A/C
先证者	M0/F0	致病	C/T	A/C
D501	M1/F1	正常	C	A	46,XN	可移植胚胎
D502	M1/F1	正常	C	A	46,XN,+（mosaic）（10）（33%）	不可移植胚胎
D503	M1/F0	携带	C/T	A	46,XN	可移植胚胎
D504	M0/F1	携带	C	A/C	44,XN,-16,-19	不可移植胚胎
D505	M0/M1	携带	C/T	A	46,XN	可移植胚胎

基于二代测序技术的常染色体隐性遗传性多囊肾病家系胚胎植入前遗传学分析

Preimplantation genetic testing of infantile polycystic kidney disease by next generation sequencing

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