基因芯片技术检测临床常见致病性念珠菌和新型隐球菌及ERG11基因点突变的实验分析

doi:10.3969/j.issn.1673-8640.2018.08.016

检验医学 ›› 2018, Vol. 33 ›› Issue (8): 742-748.DOI: 10.3969/j.issn.1673-8640.2018.08.016

基因芯片技术检测临床常见致病性念珠菌和新型隐球菌及ERG11基因点突变的实验分析

王敬华¹, 虞培娟², 葛平¹, 章强强³, 肖艳群¹, 王庆忠¹, 徐蓉¹, 陈蓉¹, 刘学杰¹, 蒋玲丽¹, 王雪亮¹, 王华梁¹

1.上海市临床检验中心,上海 200126
2.苏州大学附属第二医院检验科, 江苏苏州 215004
3. 复旦大学附属华山医院皮肤科,上海 200040

收稿日期:2017-06-07 出版日期:2018-08-10 发布日期:2018-09-07
作者简介:null
作者简介：王敬华,男,1971年生,硕士,主任技师,主要从事临床微生物学检验质量控制与管理、微生物检验自动化及细菌耐药机制研究。
基金资助:
上海市自然科学基金项目（15ZR1436100）;上海市卫生和计划生育委员会重点资助项目（20134010）;上海市公共卫生三年行动计划资助项目（15GWZK0301）

Determinations of Candida,Cryptococcus neoformans and ERG11 gene point mutations by gene chip

WANG Jinghua¹, YU Peijuan², GE Ping¹, ZHANG Qiangqiang³, XIAO Yanqun¹, WANG Qingzhong¹, XU Rong¹, CHEN Rong¹, LIU Xuejie¹, JIANG Lingli¹, WANG Xueliang¹, WANG Hualiang¹

1. Shanghai Center for Clinical Laboratory,Shanghai 200126,China
2. Department of Clinical Laboratory,the Second Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215004,China
3. Department of Dermatology,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai 200040,China

Received:2017-06-07 Online:2018-08-10 Published:2018-09-07

摘要/Abstract

摘要：

目的建立基因芯片技术检测临床常见致病性念珠菌和新型隐球菌及氟康唑耐药白念珠菌相关ERG11基因点突变的试验方法。方法针对临床常见的5种致病性念珠菌和新型隐球菌5.8S rDNA与28S rDNA间的内转录间区2（ITS-2）基因设计、合成一系列寡核苷酸探针,制备寡核苷酸芯片,以鉴定5种致病性念珠菌和新型隐球菌;设计、合成能够特异性扩增ERG11基因点突变的引物,并采用不对称荧光聚合酶链反应（PCR）扩增ERG11基因,将PCR产物与芯片进行杂交。结果采用特异性引物和不对称荧光PCR从12株临床分离耐药株中成功扩增出ERG11基因4个突变点;采用基因芯片杂交技术成功鉴定5种临床常见致病性念珠菌和新型隐球菌。结论制备的寡核苷酸基因芯片,可以用于鉴定临床常见的致病性念珠菌和新型隐球菌。

关键词: 基因芯片, 不对称荧光聚合酶链反应, 致病性念珠菌, 新型隐球菌

Abstract:

Objective To investigate the determinations of Candida,Cryptococcus neoformans and ERG11 gene point mutations by gene chip.Methods The primers and oligonucleotide probes of 5.8 S rDNA and 28S rDNA of internal transcribed spacer-2（ITS-2） gene of 5 species of pathogenic Candida and Cryptococcus neoformans were synthesized,and the oligonucleotide microarray was prepared for identification. The specific primers and oligonucleotide probes of point mutations in ERG11 gene were synthesized,and ERG11 gene was amplified by asymmetric fluorescence polymerase chain reaction（PCR）. The products were analyzed by oligonucleotide microarray.Results A total of 4 point mutations of ERG11 gene were amplified from 12 isolates of drug resistant Candida by asymmetric fluorescence PCR with specific primers,and 5 species of pathogenic Candida and Cryptococcus neoformans were identified by gene chip successfully.Conclusions The oligonucleotide microarray established in this study can be used to identify the clinical isolated pathogenic Candida and Cryptococcus neoformans.

Key words: Gene chip, Asymmetric fluorescence polymerase chain reaction, Pathogenic Candida, Cryptococcus neoformans

中图分类号:

R446.5

王敬华, 虞培娟, 葛平, 章强强, 肖艳群, 王庆忠, 徐蓉, 陈蓉, 刘学杰, 蒋玲丽, 王雪亮, 王华梁. 基因芯片技术检测临床常见致病性念珠菌和新型隐球菌及ERG11基因点突变的实验分析[J]. 检验医学, 2018, 33(8): 742-748.

WANG Jinghua, YU Peijuan, GE Ping, ZHANG Qiangqiang, XIAO Yanqun, WANG Qingzhong, XU Rong, CHEN Rong, LIU Xuejie, JIANG Lingli, WANG Xueliang, WANG Hualiang. Determinations of Candida,Cryptococcus neoformans and ERG11 gene point mutations by gene chip[J]. Laboratory Medicine, 2018, 33(8): 742-748.

图/表 10

参考文献 15

[1]	ARENDRUP M C.Invasive fungal infections:past achievements and challenges ahead[J]. Clin Microbiol Infect,2009,15(7):599-601.
[2]	王千,陈伟,万喆,等. 临床分离的携带TR34/L98H型的耐唑类药物烟曲霉的耐药机制分析[J]. 检验医学,2016,31(9):755-760.
[3]	LEONARDELLI F,MACEDO D,DUDIUK C,et a1. Aspergillus fumigatus intrinsic fluconazole resistance is due to the naturally occurring T301I substitution in Cyp51Ap[J]. Antimicrob Agents Chemother,2016,60(9):5420-5426.
[4]	BADDLEY J W,PAPPAS P G,SMITH A C,et a1. Epidemiology of Aspergillus terreus at a university hospital[J]. J Clin Microbiol,2003,41(12):5525-5529.
[5]	CHEN Y, LU Z,ZHAO J,et al.Epidemiology and molecular characterizations of azole resistance in clinical and environmental Aspergillus fumigatus isolates from China[J]. Antimicrob Agents Chemother,2016,60(10):5878-5884.
[6]	张晓利,吕雪莲,沈永年,等. 菌落PCR技术快速鉴别丝状真菌的实验研究[J]. 中华皮肤科杂志,2011,44(8):556-559.
[7]	夏乾峰,傅琼瑶,邬强,等. 荧光定量PCR检测5种假丝酵母菌方法的建立[J]. 检验医学,2015,30(3):265-268.
[8]	ZHU L X,ZHANG Z W,LIANG D,et a1. Multiplex asymmetric PCR-based oligonucleotide microarray for detection of drug resistance genes containing single mutations in Enterobacteriaceae[J]. Antimicrob Agents Chemother,2007,51(10):3707-3713.
[9]	POWERS-FLETCHER M V,HANSON K E. Molecular diagnostic testing for Aspergillus[J]. J Clin Microbiol,2016,54(11):2655-2660.
[10]	黄爱华,李君文,谌志强,等. 基因芯片技术检测鉴定临床常见致病真菌的初步研究[J]. 中华微生物学和免疫学杂志,2007,27(2):180-185.
[11]	GAST C E,BASSO L R Jr,BRUZUAL I,et a1. Azole resistance in Cryptococcus gattii from the Pacific Northwest:investigation of the role of ERG11[J]. Antimicrob Agents Chemother,2013,57(11): 5478-5485.
[12]	Clinical and Laboratory Standards Institute. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast[S]. M27-A3,CLSI,2008.
[13]	王敬华,虞培娟,葛平,等. 不对称荧光PCR扩增白念珠菌ITS-2基因单链DNA实验[J]. 检验医学,2017,32(3):210-213.
[14]	XIANG M J,LIU J Y,NI P H,et al. Erg11 mutations associated with azole resistance in clinical isolates of Candida albicans[J]. FEMS Yeast Res,2013,13(4):386-393.
[15]	DIEKEMA D J,MESSER S A,BRUEGGEMANN A B,et al.Epidemiology of candidemia:3-year results from the emerging infections and the epidemiology of Iowa organisms study[J]. J Clin Microbiol,2002,40(4):1298-1302.

编号	序列（5'~3'）	探针
1	ATTGCTTGCGGCGGTAGCGTCT- ACCACGTATATCTTCAAA	白念珠菌
2	AACGCTTATTTTGCTAGTGGCC- ACCACAATTTATTTCATA	热带念珠菌
3	TTCCACTCATTGGTACAAACTC- CAAAACTTCTTCCAAA	克柔念珠菌
4	GACGCTTGGCGGCCGAGAGCG- AGTGTTGCGAGACAACAAA	近平滑念珠菌
5	TAGGTTTTACCAACTCGGTGTT- GATCTAGGGAGGGATAAGT	光滑念珠菌
6	CCTATGGGGTAGTCTTCGGCTT- GCTGATAACAACATCTC	新型隐球菌
7	GATTGTCCAAATTCCAGATTAA- CTCGGTGTTGATC	T394C
8	CTAAATTTGCTTTGACTACTGAT- TACCAACTCGG	A427C
9	GACCGTTCATTTGCTCAACTATA- TTCTGAT	T613G
10	AGATGGTGTGAAAATGACTGAT- CAAGAAATTGCTAATCTT	T769C
11	CTGATGAAGTTGATTATGGGTT- TGGGAAAGTTTCTAA	C368T
12	CTGATTATAGTTCAATGGTGGT- TTTACCTACTGAAC	C1506A
13	TTGACCTCRRCTCAGGTAGGRA- TACCCGCTGAACTTAA	通用
14	GCATATCAATAAGCGGAGGA	阳性质控

编号	序列（5'~3'）	探针
1	ATTGCTTGCGGCGGTAGCGTCT- ACCACGTATATCTTCAAA	白念珠菌
2	AACGCTTATTTTGCTAGTGGCC- ACCACAATTTATTTCATA	热带念珠菌
3	TTCCACTCATTGGTACAAACTC- CAAAACTTCTTCCAAA	克柔念珠菌
4	GACGCTTGGCGGCCGAGAGCG- AGTGTTGCGAGACAACAAA	近平滑念珠菌
5	TAGGTTTTACCAACTCGGTGTT- GATCTAGGGAGGGATAAGT	光滑念珠菌
6	CCTATGGGGTAGTCTTCGGCTT- GCTGATAACAACATCTC	新型隐球菌
7	GATTGTCCAAATTCCAGATTAA- CTCGGTGTTGATC	T394C
8	CTAAATTTGCTTTGACTACTGAT- TACCAACTCGG	A427C
9	GACCGTTCATTTGCTCAACTATA- TTCTGAT	T613G
10	AGATGGTGTGAAAATGACTGAT- CAAGAAATTGCTAATCTT	T769C
11	CTGATGAAGTTGATTATGGGTT- TGGGAAAGTTTCTAA	C368T
12	CTGATTATAGTTCAATGGTGGT- TTTACCTACTGAAC	C1506A
13	TTGACCTCRRCTCAGGTAGGRA- TACCCGCTGAACTTAA	通用
14	GCATATCAATAAGCGGAGGA	阳性质控

编号	A	B	C
1	石膏样小孢菌	阳性对照	疣状瓶霉
2	卡式支孢霉	共有探针	总状毛霉
3	热带念珠菌	近平滑念珠菌	光滑念珠菌
4	克柔念珠菌	新型隐球菌	烟曲霉
5	白念珠菌	黄曲霉	黑曲霉
6	裴氏着色真菌	犬小孢子菌	絮状表皮癣菌
7	申克孢子丝菌	红毛癣菌	C1506A
8	T769C	T613G	T394C
9	A427C	C368T

编号	A	B	C
1	石膏样小孢菌	阳性对照	疣状瓶霉
2	卡式支孢霉	共有探针	总状毛霉
3	热带念珠菌	近平滑念珠菌	光滑念珠菌
4	克柔念珠菌	新型隐球菌	烟曲霉
5	白念珠菌	黄曲霉	黑曲霉
6	裴氏着色真菌	犬小孢子菌	絮状表皮癣菌
7	申克孢子丝菌	红毛癣菌	C1506A
8	T769C	T613G	T394C
9	A427C	C368T

引物名称	序列（5'~3'）	大小（bp）
ITS-2	P1：GGTTCTCGCATCGATGAAGA	507
	P2：TTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGT
ERG11 -1	P1：ATTGGAGACGTGATGCTGCTCAA	728
	P2：CCAAATGATTTCTGCTGGTTCAGT
ERG11 -2	P1：ATGGCTATTGTTGAAACTGTCATT	815
	P2：AAACATACAAGTTTCTCTTTTTTC
T394C	P1：CAGTTTTCGGTAAAGGGGTTAGTC	238
	P2：TCTCTAATCTTAGGAACATATCTTTTAAATG
A427C	P1：CAAATTCCAGATTAATGGAACCAC	252
	P2：TCTCTAATCTTAGGAACATATCTTTTAAATG
T613G	P1：CTATTTTCACTGCTTCAAGATCTTAAG	238
	P2：AAACAAAATTAATAGGGGTAAAACCTT
T769C	P1：GCTCAAAAGAAAATCTCTGCTTCTC	226
	P2：TTAAATCACGATTTGGATCAATATCA
C368T	P1：GCTGCTGCCAAAGCTAATTGTA	250
	P2：CACCAAATGGTAAATAAGGTGAAGAA
C1506A	P1：ACTATTGATGGTTATAAAGTGCCAGAA	252
	P2：TTTTCCCAAATGATTTCTGCTG

基因芯片技术检测临床常见致病性念珠菌和新型隐球菌及ERG11基因点突变的实验分析

Determinations of Candida,Cryptococcus neoformans and ERG11 gene point mutations by gene chip

RichHTML

PDF (PC)

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表 10

参考文献 15

相关文章 12

编辑推荐

Metrics

[1]	李达明, 吕星, 蒋传好, 胡敏. 基因芯片技术在肾移植术后患者肺部感染病原菌快速检测中的临床价值[J]. 检验医学, 2022, 37(9): 864-867.
[2]	李丹, 杜德兵, 吴文燕, 王德成. 基因芯片技术在分枝杆菌菌种鉴定和耐药性分析中的应用[J]. 检验医学, 2019, 34(2): 165-168.
[3]	王敬华, 虞培娟, 葛平, 徐蓉, 陈蓉, 刘学杰, 王华梁. 不对称荧光PCR扩增白念珠菌ITS-2基因单链DNA实验[J]. 检验医学, 2017, 32(3): 210-213.
[4]	袁青, 薛亚东, 郑雅萍, 王群英. 乙醛脱氢酶2基因多态性及生活习惯与胃癌易感性的相关性分析[J]. 检验医学, 2016, 31(7): 584-587.
[5]	缪应新, 甘洁民, 陈洁, 施泓, 姜文容, 赵虎. 上海地区人乳头瘤病毒基因芯片法分型检测的临床意义[J]. 检验医学, 2015, 30(6): 595-598.
[6]	欧维正，骆科文，王燕，秦万，蒙俊，张廷梅. 基因芯片和比例法药物敏感性试验检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性的比较研究[J]. 检验医学, 2013, 28(5): 404-407.
[7]	张春兵;范媛;詹瑧;张军峰;汪红. Ⅲ型胶原α链基因mRNA的表达与舌苔形成的关系研究[J]. 检验医学, 2007, 22(05): 524-527.
[8]	刘伟;陈双峰;王凤菊;刘义华. 高通量检测技术检测乙型肝炎病毒变异的临床意义[J]. 检验医学, 2006, 21(05): 521-523.
[9]	万均成;文芳. 在细胞计数板中直接识别脑脊液隐球菌的方法及临床意义[J]. 检验医学, 2006, 21(05): 504-508.
[10]	陈福祥;孙晓丰;施锦杰;陶艳琳. 基因芯片法和线性探针法在HCV基因分型的应用比较[J]. 检验医学, 2004, 19(01): 21-24.
[11]	张晓蓉；曹春芳；陈维媚；宋建芳；方晓霞. 罗伦特隐球菌致败血症一例[J]. 检验医学, 1999, 14(5): 278-278.
[12]	丁红；麻文清；王家林；余琼华. 6例组织胞浆菌病的实验室诊断[J]. 检验医学, 1998, 13(3): 189-189.