检验医学 ›› 2013, Vol. 28 ›› Issue (6): 511-515.DOI: 10.3969/j.issn.1673-8640.2013.06.014
赵卫卫1,彭攸1,李晓娇1,卢晓佳1,王玉平1,刘萃萃1,王璐璐1,冯景2
摘要: 目的 构建携带人EZH2 基因3′非翻译区(3′UTR)的慢病毒筛选载体并实现该重组体在人乳腺癌MCF-7中稳定整合,为下一步MicroRNAs(miRNAs)筛选奠定基础。方法 从组织中提取并用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出EZH2 基因3′UTR,构建携带EZH2基因3′UTR的重组慢病毒载体CTX-Lentivirus-EZH2 3′UTR,脂质体法将重组的慢病毒载体和包装载体混合物共转染工具细胞293T细胞,包装产生慢病毒颗粒。用裂解液裂解病毒颗粒,根据慢病毒载体上的CMV启动子表达量检测病毒滴度。用慢病毒颗粒感染乳腺癌MCF-7细胞后,通过嘌呤霉素筛选稳定整合的乳腺癌细胞MCF-7,用Real-Time PCR和Western blotting方法检测EZH2基因3′UTR是否整合入细胞MCF-7中。结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序结果证实,EZH2 基因3′UTR成功定向克隆到慢病毒载体上。Real-Time PCR检测病毒滴度为4.3×109拷贝/mL。筛选稳定整合MCF-7细胞的最佳浓度为0.2μg/mL。重组慢病毒转导MCF-7后,Real-Time PCR和Western blotting方法分别检测EZH2基因3′UTR整合到乳腺癌细胞MCF-7基因组中。慢病毒感染实验组和对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 成功构建携带EZH2基因3′UTR慢病毒筛选载体,实现重组体在乳腺癌MCF-7细胞中稳定整合。