引用本文
肖艳群, 张健, 蒋玲丽, 陈慧英, 邵维杰, 简敏华, 陆银华. 与α-烯醇化酶相关的抗内皮细胞抗体ELISA的建立及临床初步应用. 26(12): 836-839
XIAO Yanqun, ZHANG Jian, JIANG Lingli, CHEN Huiying, SHAO Weijie, JIAN Minhua, LU Yinhua. Establishment of a ELISA method for detecting anti-endothelial cell antibody related with human alpha-enolase and its primary clinical application. Labratory Medicine, 26(12): 836-839  
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与α-烯醇化酶相关的抗内皮细胞抗体ELISA的建立及临床初步应用
肖艳群, 张健, 蒋玲丽, 陈慧英, 邵维杰, 简敏华, 陆银华
上海市临床检验中心,上海 200126

作者简介：肖艳群,女,1964年生,学士,副主任技师,主要从事临床免疫和分子生物学质量控制管理工作。

基金:上海市卫生局科研计划资助项目(2008203);
摘要
目的

建立与α-烯醇化酶(ENOI)相关的抗内皮细胞抗体(AECA)的酶联免疫吸附试验(ELISA),并探讨ENOI-AECA与自身免疫性疾病的关系。

方法

人工合成获得人ENOI基因编码序列并克隆该片段构建pUC57-ENOI重组质粒,再将重组质粒亚克隆入原核表达载体pET28(a),回收酶切产物并经T4DNA连接酶连接,获得的重组表达质粒pET28(a)-ENOI,在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达蛋白,Ni NTA亲和层析纯化重组ENOI蛋白。以纯化的重组蛋白为包被抗原,并对ELISA反应条件进行优化,初步建立检测ENOI-AECA ELISA并作分析性能评价。用建立的方法分别检测健康人及系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)患者血清中的ENOI-AECA。

结果

获得了相对分子质量为47 000的高纯度人ENOI重组蛋白。ELISA抗原最佳包被浓度为5 μg/mL,血清最佳稀释倍数为1∶50。以免疫印迹法为参照,所建方法的敏感性和特异性分别为76.0%和90.2%。SLE和RA患者血清中ENOI-AECA的阳性率分别为23.1%和57.1%;RA组ENOI-AECA阳性率与健康对照组比较,差异有统计学意义(P=0.000)。

结论

以人ENOI重组蛋白为抗原建立的检测ENOI-AECA的ELISA有较高的敏感性和特异性,可用于ENOI-AECA的检测。ENOI-AECA阳性提示患者可能患有自身免疫性血管炎。

关键词: &; #x003b1; -烯醇化酶; 抗内皮细胞抗体; 酶联免疫吸附试验; 自身免疫性疾病
中图分类号:Q556 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)12-0836-04
Establishment of a ELISA method for detecting anti-endothelial cell antibody related with human alpha-enolase and its primary clinical application
XIAO Yanqun, ZHANG Jian, JIANG Lingli, CHEN Huiying, SHAO Weijie, JIAN Minhua, LU Yinhua
Shanghai Center for Clinical Laboratory, Shanghai 200126, China
Fund:
Abstract
Objective

To establish a enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method for detecting the anti-endothelial cell antibody (AECA) related with human alpha-enolase (ENOI), and investigate the relationship between ENOI-AECA and autoimmune disease.

Methods

The artificially synthesized ENOI gene coding sequence was cloned, and the recombinant plasmid pUC57-ENOI was constructed with the fragment. The recombinant plasmid was subcloned to pET28(a) vector. Both pET28(a) vector DNA and plasmid DNA were cleaved by restriction enzymes and ligated with T4 ligase. The recombinant plasmid pET28(a)-ENOI was transformed intoEscherichia coli BL21 (DE3). The cultures was induced and purified by the Ni NTA affinity chromatography. The method for detecting ENOI-AECA with ELISA was established with the purified recombinant protein as the coating antigen. The reaction conditions were optimized, and the analyzing efficiency was evaluated. The ENOI-AECAs in sera from patients with systemic lupus erythematosus(SLE) and rheumatoid arthritis (RA) and healthy controls were detected by the method.

Results

The high purity recombinant proteins of relative molecular mass 47 000 was acquired. The coating antigen concentration was 5 μg/mL, and best serum dilution was 1∶50. Compared with Western blot, the sensitivity and specificity of the established method were 76.0% and 90.2%. The ENOI-AECA positive rates in sera from SLE and RA patients were 23.1% and 57.1%, respectively. There was a statistical significance of ENOI-AECA positive rate between RA patients and healthy controls (P=0.000).

Conclusions

The ELISA method established with the purified recombinant protein as the coating antigen has high sensitivity and specificity, and it could be applied into detecting ENOI-AECA. ENOI-AECA positivity suggests that patients probably suffer from autoimmune vasculitis.

Keyword: Alpha-enolase; Anti-endothelial cell antibody; Enzyme-linked immunosorbent assay; Autoimmune disease

抗内皮细胞抗体(anti-endothelial cell antibody, AECA)可出现在与血管炎有关的多种自身免疫性疾病和免疫相关性疾病中,是这些疾病的标志性诊断指标。国外文献提示,AECA的靶抗原是多种异质性蛋白,包括细胞基质蛋白和糖酵解酶类[ 1]。近年的研究提示,这些抗原中α-烯醇化酶(ENOI)是不同类型自身免疫性疾病和免疫相关性疾病中AECA共同的靶抗原,可与自身抗体结合形成免疫复合物沉积在组织中导致病理损伤[ 2]。ENOI是1934年Lohman 和Mayerhof在研究肌肉提取物中磷酸甘油酸向丙酮酸转换的过程中发现的。一直以来均认为该酶作为糖酵解过程的限速酶,是一个古老的、保守的、功能单一的蛋白。然而最近的研究发现,该酶的功能并不仅限于催化糖酵解反应,还参与基因的转录、细胞凋亡的调控和细胞分化等过程,从而在一些生物学和病理生理过程中发挥重要作用[ 3]。

目前,检测与ENOI相关的AECA的方法报道不多,有学者采用点印迹法[ 4],由于其操作复杂,很难在一般实验室开展。而酶联免疫吸附试验(ELISA)具有操作简单、一次可检测大量样本等优势被实验室同行广泛接受。我们拟采用重组人ENOI蛋白为抗原,建立ELISA检测抗ENOI-AECA的方法,并在建立方法的基础上探讨ENOI-AECA与自身免疫性疾病的关系。

材料和方法
一、材料

1.样本 收集系统性红斑狼疮(SLE)患者、类风湿性关节炎(RA)患者 [诊断依据分别为SLE 诊治指南(2010)和RA诊治指南(2010)]和正常人血清,-20 ℃保存备用。

2.菌株、质粒载体和细胞 pET28a载体购自Fermentas公司;BL21(DE3)感受态细胞、蛋白Marker购自上海闪晶分子生物科技有限公司。

3.工具酶及主要试剂 T4DNA连接酶为Fermentas公司产品;Taq DNA聚合酶、dNTPs、琼脂糖凝胶回收试剂盒、小量质粒抽提试剂盒为上海闪晶分子生物科技有限公司产品;内切酶 Nde I和 Xho I为大连宝生物工程有限公司产品;包被液、稀释液、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG(HRP-GAH- IgG)为上海荣盛科技生物公司产品,阳性血清由上海艾比玛特公司提供。

二、方法

1.重组蛋白的制备 (1)人ENOI基因的合成:用桥式聚合酶链反应(PCR)扩增人ENOI基因序列(由上海闪晶科技生物有限公司完成),克隆到pUC57质粒上,转化宿主菌DH5a;(2)人ENOI基因重组表达质粒的构建及鉴定:将重组质粒pUC57-ENOI和空白载体pET28a分别经 Nde I、 Xho I双酶切,回收酶切产物,以T4DNA 连接酶连接,转化到BL21(DE3)感受态细胞中,37 ℃培养过夜,挑单菌培养,用T7通用引物鉴定阳性克隆,用小量质粒抽提试剂盒制备质粒,测序鉴定;(3)重组质粒pET28a-ENOI的诱导表达:将重组质粒菌在含阿米卡星LB培养基中37 ℃振荡培养1 h,加终浓度为0.5 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养16 h,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析;(4)重组蛋白的可溶性鉴定及纯化:加入苯甲基磺酰氟(PMSF)、二硫苏糖醇(DTT)分别至终浓度为1 mmol/L的诱导后的菌液中,充分裂解、冰浴、超声波破碎,离心,分别取上清、沉淀进行SDS-PAGE分析,用Ni NAT亲和层析柱纯化蛋白,具体操作按试剂说明书进行。

2.检测ENOI-AECA的ELISA的初步建立 (1)试验条件的选择:利用方阵滴定试验确定抗原包被浓度、血清稀释度和作用时间、HRP-GAH- IgG稀释度和作用时间等反应参数;(2)判断标准的确定:41份健康人阴性血清(N)测定结果均值的2倍作为阳性截断值(cut-off值)。

3.对所建方法的分析性能评价 经免疫印迹法确认的ENOI-AECA阴、阳性的血清样本各41份和25份,用本研究建立的方法测定,评价方法的敏感性和特异性。

4.临床样本的检测 用建立的方法分别检测SLE患者、RA患者和健康对照血清,同时设阴、阳性对照,分别计算阳性率。

三、统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计分析,阳性率比较采用 χ2检验, P<0.05表示差异具有统计学意义。

结果
一、重组表达质粒pET28a-ENOI的构建及鉴定

将构建的原核重组表达质粒进行测序,将测得的序列与美国国立生物技术信息中心(NCBI)公布的序列(NM001428.2)进行比对,结果完全一致。

二、重组质粒的表达

重组菌被诱导后,经SDS-PAGE示诱导表达的重组蛋白的相对分子质量为47 000,与预期结果相符,见 图1。菌液充分裂解后离心,分别取上清、沉淀作SDS-PAGE分析,结果显示目的蛋白在上清中,表明重组蛋白为可溶性蛋白。经纯化后目的蛋白纯度在95%以上,见 图2。

图1 pET28a-ENOI诱导表达分析

图2 pET28a-ENOI纯化分析注:1为纯化前;2为穿化介质后;3为第1次洗涤(50 mmol/L咪唑);4为第2次洗涤(60 mmol/L咪唑);5为第3次洗涤(70 mmol/L咪唑);6为洗脱;MW为Molecular weright marker

三、ELISA反应条件的确定

1.抗原最佳包被浓度和血清稀释度的确定 当抗原的稀释倍数为1∶64(此时蛋白浓度为5 μg/mL)、待测血清以1∶50稀释时,P/N值相对较大(0.332/0.025=13.2)。因此,确定抗原包被浓度为5 μg/mL,血清最佳稀释倍数为1∶50。

2.其他ELISA条件的确定 最佳反应条件为:用封闭液37 ℃封闭2 h,待测血清用稀释液稀释,37 ℃温育30 min,HRP-GAH- IgG用稀释液按1∶20 000稀释,37 ℃温育30 min,37 ℃显色15 min。

3.判断标准的确定 ELISA检测41份健康人血清,其吸光度( A)值均值为0.117,由此得出cut-off值为0.234, A值>0.234判为阳性,否则判为阴性。

四、所建方法分析性能评价

用所建方法测定经免疫印迹法确认的ENOI-AECA阴性血清样本41份、阳性血清样本25份,两者结果一致的样本为阴性37份、阳性19份。所建方法的分析敏感性和特异性分别为76.0%和90.2%。

五、临床血清样本的检测

用建立的ELISA分别检测SLE患者血清13份、RA患者血清28份和健康人血清41份。3组阳性率分别为23.1%、57.1%和9.7%,见 表1。

表1 ELISA检测SLE组、RA组及健康对照组血清ENOI-AECA结果[例(%)]
讨论

AECA主要见于与免疫、炎症介导的血管壁损伤相关的自身免疫性疾病,可引起细胞损伤和诱导细胞凋亡,与发病过程和病情活动明显相关。AECA抗原是位于内皮细胞表面或胞浆的多种异质性蛋白,由于抗原成分复杂,检测AECA的方法较多,不同学者先后建立了包括放射免疫分析、细胞-ELISA、荧光激活细胞分类术(FACS)、放射标记细胞提取物或免疫印迹法等方法,但不管采用何种方法,这些试验均需进行内皮细胞培养,很难确保靶抗原的合格与稳定性,也很难在一般实验室开展,限制了AECA的广泛使用。近年,Servettaz等[ 1]使用蛋白质组学技术鉴定了AECA的主要靶抗原,包括弹性纤维蛋白、微管蛋白和ENOI。此前Lee等[ 5]于2003年使用双相电泳结合质谱的方法鉴定了以血管炎为主要表现的白塞病患者体内的AECA的靶抗原是ENOI。同样的结果也见于Wagner等[ 6]对RA患者的研究,这些研究结果提示ENOI可能是以血管炎为主要表现的多种自身免疫性疾病的共同靶抗原。随着AECA抗原成分的明确,AECA在原发性血管炎及继发于结缔组织病的血管炎疾病过程中的作用将得到进一步阐明。

ENOI含有434个氨基酸,在结构上高度保守。人体内的ENOI是广泛表达的同工酶,表达于机体各种组织的内皮细胞中,ENOI体内催化2磷酸甘油酸脱氢生成磷酸烯醇丙酮酸,是糖酵解多酶复合体的主要组成部分[ 7]。同时,ENOI还可表达于内皮细胞表面,与纤溶酶原结合,参与纤维蛋白溶解作用,因此针对表达于内皮细胞表面的ENOI的自身抗体可能在相关自身免疫性疾病的发生机制中扮演重要角色,许多自身免疫性疾病的血清中都可以发现抗ENOI的自身抗体[ 6]。因此建立检测抗ENOI抗体的方法具有重要意义。

有学者利用重组人ENOI为抗原建立点印迹法检测ENOI-AECA[ 4]。此方法虽有较高的敏感性和特异性,但操作复杂,一般实验室难以开展。本研究通过重组人ENOI蛋白为抗原,初步建立了ELISA用于ENOI抗体的检测。与点印迹法相比,ELISA具有操作简单、一次可检测大量样本的优势。以免疫印迹法为参照,本研究所建立的ELISA有较高的敏感性和特异性,同时用所建方法测得RA患者血清中ENOI-AECA阳性率为57.1%,与Lee等[ 8]应用免疫印迹法的研究结果相近。表明利用重组ENOI作为检测抗原建立的ELISA可以初步用于ENOI-AECA的检测。ENOI-AECA阳性提示RA患者有血管炎并发症。

SLE患者的自身抗体识别的主要抗原成分为相对分子质量15 00097 000的多种抗原,更多集中在相对分子质量为37 00039 000、47 000、53 000的区间。本研究显示SLE患者与健康对照组抗ENOI抗体阳性率差异无统计学意义,除与本研究SLE患者病例数少有关外,还可能与SLE患者体内自身抗体靶抗原成分为多种抗原,而47 000抗原只为其主要靶抗原之一有关。尽管如此,伴有ENOI-AECA阳性的SLE患者提示有肾脏受累,可供临床作为诊治的重要参考。

值得注意的是,Chang等[ 9]曾报道ENOI被鉴定为肺癌的自身抗原,因而不排除部分肺癌患者中可能存在与ENOI相关的抗内皮细胞抗体,因此临床在应用ENOI-AECA指标时应注意对阳性结果应在排除肿瘤的前提下,方能诊断受检者存在原发性、继发性自身免疫性血管炎的可能。

综上所述,以人ENOI重组蛋白为抗原建立的ELISA为检测ENOI-AECA提供了一种简便的血清学方法,可在自身免疫性疾病ENOI-AECA检测中发挥作用。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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