引用本文
张国良, 刘鹥雯, 何怡青, 杨翠霞, 王文涓, 杜艳, 高锋. 肿瘤相关巨噬细胞模型建立的实验研究. 2014, 29(9): 897-902[ZHANG Guoliang, LIU Yiwen, HE Yiqing, YANG Cuixia, WANG Wenjuan, DU Yan, GAO Feng. The experimental study of establishing tumor-associated macrophage model. Labratory Medicine, 2014, 29(9): 897-902]  
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肿瘤相关巨噬细胞模型建立的实验研究
张国良, 刘鹥雯, 何怡青, 杨翠霞, 王文涓, 杜艳, 高锋
上海交通大学附属第六人民医院中心实验室,上海 200233

通讯作者:高锋,联系电话:021-64369181-58702。

作者简介:张国良,男,1987年生,学士,主要从事肿瘤免疫学研究。

基金:国家自然科学基金资助项目(81071814、81172027、81272479); 上海市自然科学基金资助项目(12ZR1447400);
摘要
目的

建立肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的体外分化模型。

方法

分离健康人外周血单核细胞进行体外培养;经白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素13(IL-13)刺激后,利用流式细胞术检测细胞表面标志物CD14、CD204、CD206的表达改变;利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测单核细胞白细胞介素10(IL-10)分泌量的改变;继而将刺激后的单核细胞与肿瘤细胞共培养,采用Hoechst染色观察其对肿瘤细胞的杀伤情况。

结果

经IL-4和IL-13刺激后,单核细胞表面CD14的表达率未发生明显变化,而CD204和CD206的表达显著增高,同时IL-10的分泌量也显著增高;与肿瘤细胞共培养结果显示,经IL-4/IL-13刺激的单核细胞对肿瘤细胞的杀伤能力显著下降。

结论

IL-4/IL-13可在体外诱导单核细胞呈现TAM的表型和功能,适用于TAM分化模型的建立,该模型可应用于针对TAM的相关研究。

关键词: ; 肿瘤相关巨噬细胞; 白细胞介素4; 白细胞介素13; 单核细胞; M2型巨噬细胞
中图分类号:R446.61 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2014)09-0897-06
The experimental study of establishing tumor-associated macrophage model
ZHANG Guoliang, LIU Yiwen, HE Yiqing, YANG Cuixia, WANG Wenjuan, DU Yan, GAO Feng
Center for Clinical Laboratory, Shanghai Jiaotong University Affiliated Sixth People's Hospital, Shanghai 200233, China
Abstract
Objective

To establish the differentiation model of tumor-associated macrophages (TAM) in vitro.

Methods

Monocytes were isolated from the peripheral blood of healthy subjects and cultured in vitro. After stimulation by interleukin 4(IL-4) and interleukin 13(IL-13), the expression changes of molecule markers on monocytes were determined by flow cytometry, including CD14, CD204 and CD206. The levels of interleukin 10 (IL-10) secreted by monocytes were determined by enzyme-linked iummunosorbent assay (ELISA). After coculturing with monocytes, the apoptosis of tumor cells was investigated by Hoechst staining.

Results

After stimulation by IL-4 and IL-13, monocytes exhibited a markedly altered phenotype with retained CD14, the increasing expressions of CD204 and CD206 and the increasing amount of secreted IL-10. Moreover, when coculturing with tumor cells, the cytotoxity of monocytes on tumor cells was inhibited by IL-4/IL-13.

Conclusions

IL-4/IL-13 could induce monocytes to exhibit TAM phenotype and function, indicating IL-4/IL-13 could be applied to the establishment of TAM differentiation model, which can be used in the research of TAM.

Keyword: Tumor-associated macrophage; Interleukin 4; Interleukin 13; Monocyte; M2 macrophage

恶性肿瘤发生时,外周血单核细胞浸润至肿瘤间质,逐步被诱导分化为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAM)。近年研究发现TAM不具有杀伤肿瘤细胞的功能,反而能促进肿瘤生长和发展,其表型特征和功能与M2型巨噬细胞极为相似,是一种“促进肿瘤进展的 M2 型巨噬细胞”[ 1]。TAM是肿瘤间质中的主要免疫细胞,临床研究表明TAM数量与肿瘤患者的预后呈负相关[ 2],利用基因或治疗性方法清除肿瘤局部的TAM将会抑制肿瘤进展[ 3, 4]。然而,目前缺少一种理想的TAM细胞模型来进行相关机制的研究。

在研究TAM与肿瘤细胞相互作用机制的体外试验中,目前应用最多的是利用佛波酯(phorbol myristate acetate, PMA)、白细胞介素4(interleukin 4,IL-4)和白细胞介素13(interleukin 13,IL-13)诱导的THP-1细胞作为TAM模型。在本研究中,我们利用IL-4和IL-13刺激新鲜分离的人外周血单核细胞,通过检测单核细胞表面的分子标志(CD14、CD204和CD206)、分泌的细胞因子及其杀伤功能的变化来确定其是否分化为TAM,以探索能模拟肿瘤微环境中TAM的细胞模型,便于展开相关研究。

材料和方法
一、试剂和仪器

人乳腺癌细胞株BT-549(中国科学院典型培养物保藏中心);RPMI1640培养液、胎牛血清(Gibco, 美国);别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)-抗CD14抗体及同型对照抗体、白细胞介素10(interleukin 10,IL-10) 酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒(eBioscience,美国),藻红蛋白(phycoerythrin,PE)-抗CD204抗体及同型对照抗体(R&D, 美国),PE-抗CD206抗体及同型对照抗体(Biolegend, 美国);Hoechst 33342 (碧云天,中国);流式细胞仪(Beckman Coulter, CA, 美国);倒置荧光显微镜(Olympus IX70, 日本)。

二、方法

1. 分离人外周血单核细胞 取正常人体检抗凝血,加入等体积磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)充分混匀,将稀释的全血按2∶1比例缓慢沿试管壁铺在淋巴细胞分离液上,室温下1 500× g离心20 min,小心吸出中间的云雾层细胞至另一离心管中,用RPMI1640培养液500× g离心10 min洗涤2次。将洗涤后的细胞重悬于含10%胎牛血清以及100 U/mL青、链霉素的 RPMI1640培养液中,调整细胞浓度为5×106 /mL,台盼兰拒染试验示活细胞>95%。将细胞按以上浓度接种于培养瓶中,置37 ℃、5%CO2培养箱培养2~4 h后吸出培养基,用37 ℃预热的培养液清洗3次,将未贴壁细胞洗脱。

2. 单核细胞诱导分化 上述贴壁细胞经乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)消化后离心,弃上清后重悬,接种5×105个单核细胞于T25 培养瓶中,对照组为正常培养,实验组加入IL-4和IL-13刺激。IL-4和IL-13浓度均为20 μg/mL[ 5]。确定IL-4和IL-13刺激时间的预实验如下:用上述浓度的IL-4和IL-13分别刺激单核细胞,分别在3、4、5和6 d时用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测其表面分子标志物的表达。结果显示,单核细胞表面CD204和CD206的表达在IL-4和IL-13刺激5 d后明显增加。因此,在正式实验中我们用20 ng/mL的IL-4和IL-13刺激单核细胞5 d,诱导其分化。

3. FCM检测单核细胞表面特异性抗原 实验分为常规培养组和IL-4/IL-13诱导组。单核细胞经EDTA消化后离心,弃上清后用PBS洗涤2次,计数,2组细胞均按每管约106个细胞的数量,分别收集至2个EP管中,其中实验管加入适量鼠抗人CD14单克隆抗体,对照管加入等体积CD14同型对照抗体,室温避光温育30 min,PBS洗涤2次,500 μL PBS重悬,移至流式测试管中,上机检测。应用同样方法检测单核细胞表面CD204和CD206的表达。

4. ELISA检测单核细胞分泌的IL-10 将分离的单核细胞接种于24孔板(2×105/孔),对照孔为正常培养孔,实验孔加入IL-4和IL-13(均为20 ng/mL),培养5 d后收集上清,离心去沉渣后冻存于-20 ℃冰箱。按上述方法收集3次单核细胞上清,每次均为3复孔,然后按照ELISA试剂盒说明书提供的步骤检测上清中的IL-10含量。

5. BT-549细胞转染红色荧光蛋白(red fluorescent protein, RFP) 将处于对数生长期的BT-549细胞接种于6孔板(2×105/孔),待24 h细胞生长至40%~50%融合时准备转染,弃去上清,于6孔板的每孔中加入含低浓度胎牛血清(<10%)的RPMI1640培养基1 mL,按感染复数(multiplicity,MOI)5、10、15、20加入不同滴度的慢病毒颗粒(Lentivirus-RFP),同时加入聚凝胺(终浓度5 μg/mL),充分摇匀后置37 ℃、5%CO2细胞培养箱中。作用8~12 h后用PBS洗涤细胞,加入10%胎牛血清的RPMI1640培养基继续培养,24、48和72 h后在荧光显微镜下观察转染细胞的红色荧光和细胞毒性反应,以此确定大致转染效率(最佳点时拍照)。利用嘌呤霉素筛选阳性细胞,每隔2~3天加1次抗菌药物,连续筛选2~3次,之后继续培养、传代扩增,建立稳定的细胞株。

6. Hoechst染色检测肿瘤细胞凋亡 将分离的单核细胞接种于24孔板(5×104/孔),对照孔为正常培养孔,实验孔加入IL-4和IL-13(均为20 ng/mL),培养5 d后弃上清,EDTA消化后离心,弃上清后用RPMI1640培养液重悬,将其分别加入事先接种RFP-BT-549细胞的(2×104/孔,培养24 h) 24孔板中。2种细胞共培养24 h后,PBS洗涤2次,4%多聚甲醛室温固定10 min,PBS洗涤后加入适量Hoechst 33342染液,4 ℃避光温育过夜。观察之前PBS洗涤3次,荧光显微镜下细胞核浓缩、染色致密者即为处于凋亡状态的肿瘤细胞,计数。

三、统计学方法

每组数据均来自3次独立的实验,结果用 ±s 表示,用SPSS 16.0软件对数据进行 t检验,以 P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、外周血单核细胞鉴定

分离人外周血单核细胞后,利用FCM检测单核细胞表面特异标志物CD14的表达率,以确定其纯度。结果显示所分离单核细胞的CD14表达率为97.56%±1.85%。见图1。

图1 人外周血单核细胞表面CD14表达

二、IL-4/IL-13 诱导单核细胞表达TAM标志分子

正常培养组单核细胞表面CD204和CD206的表达率均较低,IL-4/IL-13(20 ng/mL)诱导组单核细胞表面CD204和CD206的表达率均显著增高( P<0.001),CD14的表达率无明显差异。见图2。

图2 单核细胞表面CD14、CD204和CD206的表达

三、IL-4/IL-13促进单核细胞分泌IL-10

常规培养组单核细胞的IL-10分泌量较低[(6.19±3.12) ng/mL],IL-4/IL-13(20 ng/mL)刺激组单核细胞的IL-10分泌量显著增加[(18.63±10.20)ng/mL, P<0.05]。见图3。

图3 ELISA检测单核细胞IL-10的分泌量

四、 TAM对肿瘤细胞的杀伤功能

常规培养的RFP-BT-549细胞未观察到凋亡现象;RFP-BT-549细胞与正常单核细胞共培养后,出现大量的凋亡细胞;当RFP-BT-549细胞与IL-4/IL-13诱导后的单核细胞共培养时,RFP-BT-549细胞的凋亡率显著降低( P<0.001)。见图4。

图4 Hoechst染色观察肿瘤细胞凋亡

讨论

TAM在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用,可表现在多个环节,其中包括分泌多种生长因子,促进肿瘤细胞的生长[ 6, 7];分泌多种蛋白酶,破坏肿瘤细胞周围的基底膜,从而间接促进肿瘤细胞向周围组织侵袭[ 8, 9];分泌大量促进血管生成的细胞因子和调节血管生成的酶类,并可表达血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)-C 和 VEGF-D,从而促进肿瘤血管和淋巴管的生成[ 10, 11, 12];与肿瘤化疗耐药性密切相关[ 13, 14]。TAM已成为抗肿瘤治疗的作用靶点,而TAM与肿瘤细胞相互作用机制也成为近年研究的热点,但目前缺乏一种理想的TAM细胞模型。现有研究手段主要利用商品化的人外周血单核白血病细胞株THP-1作为巨噬细胞分化的模型,在PMA及IL-4/IL-13的作用下可分化为具有M2表型的巨噬细胞,以作为TAM模型。在体外实验中,将该TAM模型与肿瘤细胞共培养,研究其相互作用及机制[ 15, 16]。然而,THP-1细胞是一种幼稚的单核白血病细胞,处于低分化状态,并不具备人外周血单核细胞所具有的各项免疫学功能。虽然THP-1细胞在PMA及IL-4/IL-13的诱导下可呈现M2型巨噬细胞的表型,但在功能方面并不能模拟单核细胞来源的TAM,因此用其作为TAM模型并不能真正模拟肿瘤微环境中的TAM。

在本研究中,我们分离健康人外周血单核细胞,并利用FCM检测分离纯度。利用IL-4/IL-13刺激纯化的单核细胞后,发现其表面标志物CD204、CD206表达明显增高,IL-10的分泌量也显著升高。CD204是巨噬细胞清道夫受体1(macrophage scavenger receptor 1, MSR1),CD206是巨噬细胞甘露糖受体(macrophage mannose receptor,MMR);IL-10是一种抑制炎性反应的细胞因子,可下调巨噬细胞表面主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ以及协同刺激分子CD80和CD86的表达,使其抗原呈递能力降低,并可抑制巨噬细胞分泌炎性细胞因子和化学因子,使其促炎症能力降低[ 17]。通过经典途径激活的巨噬细胞(M1型巨噬细胞)低表达CD204和CD206,其IL-10的分泌量也较低。而在肿瘤微环境中各种因素的作用下,TAM高表达CD204和CD206,并分泌较多的IL-10[ 18, 19]。本研究中,经IL-4/IL-13诱导的单核细胞高表达CD204和CD206,其IL-10分泌量也显著增高,呈现出TAM的表型。

与表型改变相比,TAM的功能改变同样重要。TAM呈现M2型巨噬细胞的功能,失去了对肿瘤的杀伤能力。本研究结果显示,与对照细胞相比,IL-4/IL-13诱导的单核细胞对肿瘤细胞的杀伤能力显著降低,从而证实其具有TAM的功能。据报道,人外周血单核细胞经巨噬细胞集落刺激因子诱导5~7 d后再经IL-4/IL-13诱导3 d可作为TAM模型[ 5]。本研究利用IL-4/IL-13诱导人外周血单核细胞5 d后也可使其呈现TAM的表型和功能,与现有方法相比,缩减了步骤和时间,可操作性更强,但还需进一步的实验验证该TAM模型的稳定性和实用性,以便未来广泛的应用。

综上所述,本研究已成功建立了TAM体外分化的细胞模型,与利用THP-1细胞建立的TAM模型相比,本研究利用人外周血单核细胞建立的TAM模型在表型及功能方面更能模拟肿瘤微环境中的TAM,可用于研究TAM与肿瘤细胞之间的相互作用及其机制。

The authors have declared that no competing interests exist.

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