引用本文
白钰, 张莉, 马晓丽, 孔彬, 李新霞, 李新宇. RP-HPLC-荧光法测定大鼠海马组织中5种氨基酸类神经递质. 检验医学, 2014, 29(1): 69-72[BAI Yu, ZHANG Li, MA Xiaoli, KONG Bin, LI Xinxia, LI Xinyu. The determination of 5 amino acid neurotransmitters in hippocampus of rats by RP-HPLC with fluorescence detector. Labratory Medicine, 2014, 29(1): 69-72]  
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RP-HPLC-荧光法测定大鼠海马组织中5种氨基酸类神经递质
白钰1, 张莉2, 马晓丽3, 孔彬3, 李新霞3, 李新宇4
1.新疆医科大学附属中医医院, 新疆 乌鲁木齐 830011
2.石河子大学医学院, 新疆 石河子 832002
3.新疆医科大学分析测试中心, 新疆 乌鲁木齐 830011
4.兰州军区乌鲁木齐总医院, 新疆 乌鲁木齐 830011
基金:国家自然科学基金资助项目 (81260144);天普基金资助项目 (01201040)
摘要
目的 采用反相高效液相色谱 (RP-HPLC)-荧光检测技术建立一种用于测定脑海马组织中5种氨基酸[天门冬氨酸 (Asp) 、谷氨酸 (Glu) 、天冬酰胺 (Aspa) 、谷胺酰胺 (Gln) 、甘氨酸 (Gly)]类神经递质的方法。方法 采用甲醇∶水＝1∶1提取大鼠脑海马组织中多种氨基酸类神经递质。用6-氨基喹啉基-N-羟基-琥珀酰亚胺氨基甲酸酯 (AQC) 柱前衍生RP-HPLC-荧光法测定海马组织中Asp、Glu、Aspa、Gln、Gly含量。结果 5种氨基酸类神经递质在15 min内完全分离, 分离效果良好;在0.5～100.0 μg/μL范围有较好的线性关系, 相关系数(r)≥0.999 90;Asp、Glu、Aspa、Gln、Gly的检出限分别为0.05、0.068、0.037、0.05、0.02 μg/μL。精密度[相对标准偏差 (RSD)]为0.4%～2.5%,加样回收率为70.27％～128.20％, RSD均＜5%;8只正常大鼠海马组织中Asp、Glu、Aspa、Gln、Gly含量分别为38.98±9.66、126.42±34.06、216.00±0.75、90.44±33.75、 (12.95±4.42) μg/g。结论 RP-HPLC-荧光法快速、准确、灵敏度高, 适用于脑组织中氨基酸类神经递质含量的测定。
关键词: 氨基酸; 神经递质; 高效液相色谱; 柱前衍生
The determination of 5 amino acid neurotransmitters in hippocampus of rats by RP-HPLC with fluorescence detector
BAI Yu1, ZHANG Li2, MA Xiaoli3, KONG Bin3, LI Xinxia3, LI Xinyu4
1.Traditional Chinese Medicine Hospital of Xinjiang Medical University, Xinjiang Urmqi 830011, China
2. Shihezi University School of Medicine, Xinjiang Shihezi 832002, China
3. Analytic and Testing Center of Xinjiang Medical University, Xinjiang Urmqi 830011, China
4. Lanzhou Military Region Urmqi General Hospital, Xinjiang Urmqi 830011, China
Abstract
Objective To establish a method of reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) with fluorescence detector to determine 5 amino acid [aspartate (Asp), glutamate (Glu), asparagine (Aspa), glutamine (Gln) and glycine (Gly)] neurotransmitters.Methods The amino acid neurotransmitters in hippocampus of rats were collected by methanol: water=1∶1. The RP-HPLC with fluorescence detector with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC) pre-column derivatization was used to measure the 5 amino acid neurotransmitters in hippocampus of rats.Results The 5 amino acid neurotransmitters were well and completely separated using elution within 15 min. There was a good linear correlation in the range of 0.5-100.0 μg/μL, and the correlation coefficient (r) was≥0. 999 90. The detection limits of Asp, Glu, Aspa, Gln and Gly were 0.05, 0.068, 0.037, 0.05 and 0.02 μg/μL. The precisions [relative standard deviation (RSD)] were 0.4%-2.5%. The recoveries of added amino acids were 70.27%-128.20%(RSD<5%).The contents of Asp, Glu, Aspa, Gln and Gly in hippocampus of normal rats were 38.98±9.66, 126.42±34.06, 216.00±0.75, 90.44±33.75 and (12.95±4.42) μg/g.Conclusions RP-HPLC with fluorescence detector is quick, reliable and sensitive to measure the amino acid neurotransmitters in hippocampus of rats.
Keyword: Amino acid; Neurotransmitter; High performance liquid chromatography; Pre-column derivatization

氨基酸类神经递质主要包括兴奋性氨基酸[如谷氨酸 (glutamate, Glu) 、天门冬氨酸 (aspartate, Asp)]和抑制性氨基酸[如甘氨酸 (glycine, Gly)]两大类。这些神经递质主要分布于哺乳动物的脑组织中, 起着维护脑内正常生理功能的关键作用[ 1]。因此, 定量测定脑组织中这些氨基酸神经递质的含量对研究神经系统生理[ 2]、脑血管病具有重要的应用价值。

目前, 生物样品中的氨基酸含量测定多采用高效液相色谱 (HPLC) 法、气相色谱和毛细管电泳等[ 3, 4]。柱前衍生HPLC法由于其高度的选择性和快速性成为药物和临床样品中氨基酸分析的首选方法。目前, 常用的衍生试剂主要有邻苯二甲醛 (OPA)[ 5]、异硫氰酸酯 (PITC)[ 6]、丹磺酰氯 (DNS-Cl)[ 7]等, 6-氨基喹啉基-N-羟基-琥珀酰亚胺氨基甲酸酯 (AQC) 是Waters公司开发出的一种专利氨基酸衍生试剂, 具有快速、高效、稳定的衍生特点, 已被广泛应用于食品中氨基酸含量的监测, 但对生物样本中氨基酸的检测未见报道。

由于脑内氨基酸含量较低, 因此我们采用AQC这种新型荧光衍生试剂, 运用柱前衍生反相 (reverse phase, RP)-HPLC-荧光法测定正常大鼠海马组织中5种氨基酸类神经递质的含量。

材料和方法
一、仪器与试剂

WATERS e2695型高效液相色谱仪 (包括UV-2489紫外检测器、2475荧光检测器),SUPELCOSIL LC-18色谱柱 (250 mm×4.6 mm, 5 μm, Sigma公司),Empower 3色谱工作站;BS 110S型分析天平 (Sartorius公司, d=0.1 mg);SK-1型快速混匀器 (金坛市医药仪器厂);PB-10型pH计 (Sartorius公司);溶剂过滤装置;MULTIFUGE X3R型离心机 (Thermo公司);DK-S22型水浴锅 (上海精宏实验有限公司).

氨基酸[Asp、Glu、天冬酰胺 (Aspa) 、谷胺酰胺 (Gln) 、Gly]对照品购自上海国药集团化学试剂有限公司, 纯度均＞98%。

AccQ·Fluor氨基酸衍生试剂盒 (美国Waters公司, 包括AQC粉末2A、2B和硼酸盐缓冲液),乙腈和甲醇为色谱纯;超纯水由milli-Q超低有机物超纯水机 (美国Millipore公司) 制备, 其他试剂均为分析纯。

二、实验动物

Wistar 大鼠, 体重250～280 g, 雌雄不拘, 由新疆医科大学动物实验中心提供 (医动字第16-003号) 。

三、色谱条件

流动相A:准确称取7.4 g无水乙酸钠, 加水930 mL, 溶解后用冰醋酸调 pH 值至6.5, 然后加乙腈70 mL, 混匀, 用0.45 μm滤膜过滤。流动相B:甲醇∶乙腈∶水＝20∶60∶20。柱温:37 ℃;荧光检测, 激发波长235 nm, 发射波长395 nm;流速:1.0 mL/min, 进样量5 μL。线性梯度洗脱:0 min, 0%B;5 min, 2%B;10 min, 5% B; 12 min, 0%B;20 min, 100% B。

四、溶液配制

1.对照品溶液配制 精密称取5种氨基酸对照品各约10 mg, 分别置于10 mL容量瓶中, 用0.1 mol/L HCl稀释至刻度, 摇匀, 制得浓度为1 mg/mL的氨基酸储备溶液, 4 ℃冰箱放置。精密吸取各储备液适量置同一10 mL容量瓶中, 用超纯水稀释并定容, 混匀作为工作液, 依次逐级稀释配制系列浓度工作液, 按照上述色谱条件进样。

2.衍生试剂的配制 精密量取1 mL AccQ·Fluor 2B试剂加入装有AccQ·Fluor 衍生剂粉末的2A 瓶中, 加盖密封, 旋涡震荡10 s, 55 ℃水浴加热10 min, 直至AccQ·Fluor 衍生剂粉末全部溶解, 即得浓度为10 mmol/L衍生化试剂, 置干燥器中避光保存备用。

五、氨基酸对照品的衍生化反应

精密量取混合氨基酸对照品10 μL, 置于进样衬管中, 加入硼酸缓冲液70 μL和配制好的AQC试剂10 μL, 在涡旋振荡器上混匀, 室温放置1 min转入进样瓶, 水浴加热55 ℃ 10 min, 直接进样5 μL进行色谱分析。AQC与氨基酸反应的方程式见图1:

图1 AQC与氨基酸反应方程式

六、大鼠海马组织预处理及衍生化反应

分别取大鼠脑海马, 称湿重, 以甲醇∶水 (V/V)=1∶1的比例加入1 mL, 冰浴下充分匀浆;匀浆液在4 ℃下13 000×g低温离心15 min, 取上清液, 用0.22 μm 滤膜过滤。 精密吸取上清液10 μL, 按照氨基酸对照品的衍生化反应步骤进行衍生化反应, 进样5 μL色谱分析。

结 果
一、氨基酸对照品及大鼠海马组织的HPLC图谱

混合氨基酸对照品溶液和海马组织样品中5种氨基酸的分离谱图见图2。15 min内各氨基酸均得到完全、有效的分离, 峰形良好, 无重合、拖尾等现象。

二、线性范围和检测限

检测配制好的系列浓度混合氨基酸对照品溶液, 以氨基酸峰面积为纵坐标, 浓度为横坐标进行线性回归, 按信噪比 (S/N)=3计算各氨基酸的检测限。5种氨基酸的峰面积和浓度之间的线性关系良好, 相关系数(r)为0.999 90～0.999 97, 见表1:

表1 氨基酸的线性范围及检测限

三、精密度、稳定性和加标回收率实验

取已知浓度的氨基酸混合对照品连续进样5次, 结果表明5种氨基酸峰面积的相对标准偏差 (RSD) 为0.4%～2.5%,重现性良好。

图2 混合氨基酸对照品和大鼠海马组织的HPLC图谱

注:(a) 混合氨基酸对照品;(b) 大鼠海马组织;1为Asp, 2为 Glu, 3为Aspa, 4为Gln, 5为Gly

取已知浓度的混合氨基酸对照品衍生化后于第0、2、4、8、12 h进样分析, 测得5种氨基酸衍生物色谱峰峰面积的RSD为0.7%～3.8%,表明海马组织经AQC衍生化后至少在12 h内保持稳定。

取混合海马组织样品作为质控 (QC) 样品, 分别加入已知浓度的混合氨基酸对照品溶液, 进样分析, 计算方法的回收率。5种氨基酸的加标回收率为70.27％～128.20％, RSD均＜5%,表明本法能准确测定样品中多种氨基酸类神经递质。见表2:

表2 回收率测定结果

三、样品分析

分别用建立的氨基酸衍生方法测定8只正常大鼠海马组织中的5种氨基酸类神经递质, 用标准曲线法分别计算各种氨基酸的含量。结果显示大鼠海马组织中Asp、Glu、Aspa、Gln、Gly的含量分别为38.98±9.66、126.42±34.06、2.16±0.75、90.44±33.75、 (12.95±4.42) μg/g。

讨 论

本研究建立了适用于大鼠海马组织中5种氨基酸类神经递质的RP-HPLC-荧光检测方法。在探索该样品测定方法时, 主要考察了海马样品提取方法[ 8],分别选用生理盐水、甲醇、甲醇/水进行提取, 高氯酸除蛋白后进行衍生反应。经过对比, 发现直接用1∶1的甲醇/水既可以达到提取作用, 又可以同时除去组织中蛋白质, 提取回收率达到80%以上。因此样品制备最终选择直接用等比例的甲醇/水处理后直接衍生化反应进样分析。

在衍生试剂选择上, 本研究没有选用文献常用的OPA[ 8, 9, 10, 11, 12]。因为OPA需要衍生后快速进样, 且衍生产物不稳定, 在1.5 min后会快速降解, 存在重复性差等情况。因此, 本研究选用新的荧光衍生试剂AQC, 采用梯度洗脱同时测定大鼠海马组织中5种神经递质的含量。方法学研究证明AQC衍生样品后在12 h内均符合稳定性要求, 且该方法对样品预处理及测定有操作简单、灵敏、色谱峰分离效果极佳、分离时间短的优点, 仅需12 min便能完成5种递质的完全分离。综合这些特点说明AQC优于以往常用的OPA, 适合脑内微量神经递质测定。

在回收率测定中, 由于本研究未选用内标进行样本萃取回收的实验, 而是利用外标法直接进行定量测定, 可能会存在一定误差, 希望在以后的试验中进一步进行深入研究。

综上所述, 本研究采用AQC衍生, RP-HPLC结合荧光检测法对氨基酸进行分离检测。方法学验证结果显示该法灵敏度高, 重现性好, 方法简便、快速, 可以为海马组织中氨基酸类神经递质的分析检测提供一种新手段, 并为广大医务及科研工作者在临床监测及科研方面提供参考。

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