引用本文
严育忠, 范惠清, 郑文龙, 杨焕章, 陆燕春, 石毅. 改良亚胺培南-EDTA纸片增效试验检测铜绿假单胞菌产金属酶表型. 检验医学, 2014, 29(1): 65-68[YAN Yuzhong, FAN Huiqing, ZHENG Wenlong, YANG Huanzhang, LU Yanchun, SHI Yi.. The phenotypic detection of metallo-beta-lactamase-producing Pseudomonas aeruginosa by modified imipenem-EDTA disk potentiation test. Labratory Medicine, 2014, 29(1): 65-68]
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改良亚胺培南-EDTA纸片增效试验检测铜绿假单胞菌产金属酶表型
严育忠, 范惠清, 郑文龙, 杨焕章, 陆燕春, 石毅
上海市浦东医院检验科, 上海 201300
基金:上海市浦东医院“南箐奖”资助项目
摘要
目的 评估改良亚胺培南-乙二胺四乙酸 (EDTA) 纸片增效试验在检测铜绿假单胞菌 (PA) 产金属酶表型中的应用价值。方法 收集95株耐碳青霉烯类药物PA, 采用琼脂稀释法测定所有菌株对亚胺培南和美罗培南的最低抑菌浓度 (MIC) 值, 聚合酶链反应 (PCR) 和DNA测序鉴定金属酶基因型, 亚胺培南-EDTA纸片增效试验常规法和改良法检测金属酶表型。结果 95株耐碳青霉烯类药物PA对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为100.0%和71.6%;常规法敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别是100.0%、96.6%、72.7%和100.0%, 而改良法均为100.0%。结论 改良亚胺培南-EDTA纸片增效试验可能是一种检测PA产金属酶表型的有效方法。
关键词: 金属酶;铜绿假单胞菌;纸片增效试验
The phenotypic detection of metallo-beta-lactamase-producingPseudomonas aeruginosaby modified imipenem-EDTA disk potentiation test
YAN Yuzhong,FAN Huiqing,ZHENG Wenlong,YANG Huanzhang,LU Yanchun,SHI Yi.
Department of Clinical Laboratory, Pudong Hospital, Shanghai 201300, China
Abstract
Objective To evaluate the modified imipenem-ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) disk potentiation test for the phenotypic detection of metallo-beta-lactamase-producingPseudomonas aeruginosa(PA).Methods A total of 95 carbapenem-resistant PA were collected. The minimum inhibition concentrations (MIC) of imipenem and meropenem were determined by agar dilution method.Polymerase chain reaction (PCR) and DNA sequencing were used for the identification of metallo-beta-lactamase genotypes. The phenotypic detection of metallo-beta-lactamase was done by conventional and modified imipenem-EDTA disk potentiation test.Results The resistance rates of imipenem and meropenem were 100.0% and 71.6% among these 95 carbapenem-resistant PA. The sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value of conventional test were 100.0%, 96.6%, 72.7% and 100.0%, respectively. Those of modified test were all 100.0%.Conclusions The modified imipenem-EDTA disk potentiation test could be an effective method for the phenotypic detection of metallo-beta-lactamase-producing PA.
Keyword: Metallo-beta-lactamase; Pseudomonas aeruginosa; Disk potentiation test

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA) 是一种医院感染的重要条件致病菌。近年来产金属酶PA在我国呈广泛播散的趋势, 广泛耐药PA感染率逐年增多[ 1],产金属酶PA感染患者的死亡率也在逐年上升[ 2]。因此及时检测产金属酶PA对合理使用抗菌药物及控制病原菌播散非常重要[ 3, 4, 5]。乙二胺四乙酸 (ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA) 是一种应用比较普遍的金属酶抑制剂, 但其是通过膜渗透作用来增加细菌对抗菌药物的敏感性。因此目前普遍采用的纸片增效试验出现了较高的假阳性率[ 6, 7]。我们将这一方法进行改良, 先提取待测菌株酶液, 去除了菌膜的影响因素。在试管内预先将EDTA和酶液进行反应, 以大肠埃希菌 (ATCC 25922) 为指示菌, 观察亚胺培南-EDTA纸片增效试验检测金属酶表型的效率。

材料和方法
一、材料

1. 试验菌株和质控菌株 (1) 试验菌株:收集2010年1至12月上海市浦东医院临床分离的对碳青霉烯类药物 (亚胺培南和/或美罗培南) 耐药PA 95株, 试验前所有菌株经Vitek 2 Compact全自动鉴定系统重新鉴定;(2) 质控菌株:大肠埃希菌 (ATCC 25922),PA (ATCC 27853) 。

2. 抗菌药物及标准品 药物敏感性纸片[亚胺培南 (10 μg) 纸片和美罗培南 (10 μg) 纸片]购于英国Oxoid公司, 亚胺培南粉剂为杭州默沙东制药有限公司商品, 美罗培南标准品为卫生部中国生物制品药品鉴定所标准品。

3. 试剂及仪器 EDTA为Sigma公司商品, Vitek 2 Compact全自动鉴定系统 (法国生物梅里埃公司) 、TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice (日本TaKaRa公司) 、电泳槽、凝胶成像系统 (美国BIO-RAD公司) 和加热仪等。引物由上海生工生物工程有限公司合成, 聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR) 扩增试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。

二、方法

1. 药物敏感性测定 采用琼脂稀释法测定所有菌株对亚胺培南、美罗培南和厄他培南的最低抑菌浓度 (minimal inhibitory concentrations, MIC) 值, 浓度范围为0.125～128 μg/mL, 试验操作与结果判断均按美国临床实验室标准化协会 (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI) 标准[ 8]进行。

2. EDTA纸片增效试验检测金属酶 (1) 常规方法:参考文献[9],以0.5麦氏单位待检菌菌液均匀涂布在水解酪蛋白胨琼脂平板, 中间贴亚胺培南药物纸片2张, 其中一张亚胺培南药物纸片上加0.1 mmol/L EDTA溶液10 μL, 纸片间距>4 cm, 35 ℃过夜培养, 结果以△=d (亚胺培南+EDTA) －d (亚胺培南) ≥5 mm为阳性;(2) 改良法:①酶液制备, 将待检菌株接种在水解酪蛋白胨肉汤中增菌, 离心收集细菌, 用0.01 mmol/L磷酸盐缓冲液冲洗后制成一定浓度的细菌液, 再用冻融法(-70 ℃快速冷冻和37 ℃水浴快速解冻, 反复5次) 破碎菌细胞, 使其菌体内的酶释放出来, 再离心 (22 000×g,1 h) 去除细菌碎片, 收集上清液即为酶液粗提物;②反应液制备, 上述酶液和EDTA以4∶1的比例制备, 以0.5麦氏浊度单位的大肠埃希菌 (ATCC 25922) 菌液均匀涂布于水解酪蛋白胨平板, 分别贴亚胺培南、亚胺培南+EDTA (10 μL) 、亚胺培南+酶液 (10 μL) 和亚胺培南+反应液 (10 μL) 4张纸片, 纸片间距>4 cm, 35 ℃过夜培养, 亚胺培南和亚胺培南+EDTA 2 张纸片为空白对照, 结果判断以△=d (亚胺培南+反应液) －d (亚胺培南+酶液) ≥5 mm为阳性。

3. PCR扩增 煮沸法提取细菌DNA模板, 扩增IMP-1、IMP-2、VIM-1、VIM-2、SIM-1、SPM-1、GIM共7组金属酶基因, 所需的引物序列和PCR反应条件均按参考文献[10-11]进行。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳, 凝胶成像系统观察结果并照相。PCR扩增产物送上海生工生物工程有限公司进行双脱氧链末端终止法测序, 结果在GenBank上查询。

三、统计学方法

药物敏感性试验结果用WHONET5.4软件进行统计分析。以PCR检测结果为金标准, 以敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值评估2种纸片增效试验检测金属酶的效果。

结果
一、药物敏感性试验

95株PA对亚胺培南和美罗培南的MIC值分别为8～>128 μg/mL和0.125～>128 μg/mL。亚胺培南的耐药率为100.0%(95/95),美罗培南的耐药率、中介率和敏感率分别为71.6%(68/95) 、2.1%(2/95) 和26.3%(25/95) 。其中, 有68株亚胺培南和美罗培南均表现为耐药, 25株亚胺培南耐药而美罗培南敏感, 2株为亚胺培南耐药而美罗培南中介。见表1:

表1 95株受试菌对亚胺培南和美罗培南的药物敏感性分析

二、PCR扩增金属酶基因及DNA测序结果

PCR扩增检出8株金属酶基因阳性菌株, 占95株碳青霉烯类抗菌药物不敏感PA菌株的8.4％。DNA测序结果显示, 7株含IMP-9型基因, 1株含VIM-2型基因。

三、常规及改良亚胺培南-EDTA纸片增效试验结果比较

常规法8株产金属酶菌株均显示阳性结果, 同时有3株不产金属酶菌株显示阳性结果;改良法与PCR结果均一致, 见表2。改良后亚胺培南-EDTA纸片增效试验结果见图1。其中在图1 (b) 中, 金属酶阴性PA菌株改良法呈阴性结果, 值得指出的是在部分菌株的试验中, 含酶液的纸片抑菌圈比不含酶液的纸片抑菌圈小, 原因有待进一步研究。

表2 95株受试菌PCR结果与常规法及改良法的比较

注:(a) 、 (b) 、 (c) 分别为1株金属酶阳性 (产IMP-9型酶) PA、1株金属酶阴性PA和PA (ATCC 27853);IPM为亚胺培南

图1 改良后的亚胺培南-EDTA纸片增效试验结果

四、方法学分析

亚胺培南-EDTA纸片增效试验常规法和改良法的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值见表3:

表3 常规法与改良法的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分析(%)

讨 论

上世纪90年代发现产金属酶PA, 金属酶基因常位于Ⅰ类整合子和质粒等遗传物质上, 可发生水平传播[ 3, 12, 13]。由于碳青霉烯类药物被认为是目前抗革兰阴性杆菌的最后一道防线, 细菌产金属酶往往会对此类药物产生耐药, 因此对于金属酶的检测有利于感染的治疗和控制[ 14]。

PA对碳青霉烯类药物耐药除因产金属酶外, 其他因素如0prD2膜蛋白缺失或减少、泵出机制MexAB-0prM的高表达也可使PA对不同碳青霉烯类药物表现出不同的耐药性。本研究中95株耐碳青霉烯类药物PA对亚胺培南的耐药率明显高于美罗培南, 与文献报道[ 15]一致, 主要原因可能是0prD2蛋白的缺失或减少所致。他们对亚胺培南和美罗培南的耐药结果以二者均耐药和前者耐药后者敏感2种模式为主, 而8株产酶菌株为均耐药模式。25株表现为亚胺培南耐药而美罗培南敏感模式的菌株经金属酶基因PCR扩增后结果均显示阴性。

目前国内耐碳青霉烯类药物PA产金属酶比例在10%左右[ 16]。本研究对95株耐碳青霉烯类药物PA进行PCR检测金属酶基因, 结果阳性率为8.4%。金属酶具有碳青霉烯酶及依赖金属的特性, 改良Hodge试验仅针对碳青霉烯酶水解活性, CLSI文件不推荐对PA进行金属酶的检测。由于E-test成本昂贵, PCR技术要求较高, 使得E-test和PCR均不适合作为常规试验。EDTA因获取容易、价格低廉是实验室常用的金属酶抑制剂, EDTA的纸片增效试验具有操作简单、结果易读的特点。然而常规的纸片增效试验中, EDTA一方面因抑制待测菌株的生长可能导致假阳性结果, 而且EDTA浓度越高假阳性率越高[ 9, 17, 18];另一方面因增强了细菌膜通透性, 细菌对抗菌药物敏感性的增加也可能导致假阳性结果[ 6, 7]。因此我们对常规的试验方法进行了改良, 通过提取受试菌酶液, 预先将酶液和EDTA在试管内进行反应, 同时反应液中EDTA的相对用量也比常规法少, 使得EDTA对试验的影响明显下降。在常规试验中, 3株假阳性菌株采用改良试验均显示阴性结果。我们推测在目前PA对碳青霉烯类药物耐药性主要受膜蛋白影响的情况下, 常规试验的假阳性率可能会比较高, 有文献报道耐碳青霉烯类药物PA菌株常规试验阳性, 对金属酶基因PCR扩增结果均为阴性[ 19]。本研究结果显示, 经过改良后的亚胺培南-EDTA纸片增效试验对耐碳青霉烯类药物的PA金属酶的检测敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值均为100.0%,取得了非常好的效果。

综上所述, 改良后的亚胺培南-EDTA纸片增效试验较常规法检测效果更好, 但本研究菌种及标本数量有限, 金属酶也仅包括了亚胺培南和美罗培南2种, 尚需扩大标本量进一步研究。

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