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蒋玲丽, 王雪亮, 肖艳群, 王华梁. 荧光定量PCR测定HBV DNA室内质控方法的探讨. 检验医学2014, 29(6):668-670
JIANG Lingli, WANG Xueliang, XIAO Yanqun, WANG Hualiang. The investigation on the internal quality control of HBV DNA determination by fluorescence quantitation PCR. Labratory Medicine, 2014, 29(6):668-670  
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荧光定量PCR测定HBV DNA室内质控方法的探讨
蒋玲丽, 王雪亮, 肖艳群, 王华梁
上海市临床检验中心,上海 200126

作者简介:蒋玲丽,女,1980年生,硕士,主管技师,主要从事免疫学和分子生物学的质量控制工作。

基金:上海市卫生计划委员会重要疾病联合攻关项目(2013ZYJB0010);
摘要
目的

探讨实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)测定乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)的室内质控方法。

方法

统计上海地区PCR实验室HBV DNA常规条件下前20次室内质控数据的不精密度(CV),以测出的均值(x-±s)绘制质控图,分别采用13s/22s的多规则质控方法和Levey-Jennings单规则质控方法,判断前20次室内质控数据CV分别为≥10%、5%~<10%和1%~<5%范围内A、B和C 3家实验室的室内质控数据,分别分析其失控检出能力。

结果

分别采用13s/22s多规则和Levey-Jennings单规则质控方法。当HBV DNA室内质控品低、高两个浓度分别为5×104和5×106 IU/mL时,CV为14.96%和12.15%的A实验室均未正确检出失控数据;CV为6.49%和5.00%的B实验室检出2个随机误差引起的失控数据;其CV为4.36%和2.43的C实验室,采用13s/22s多规则质控方法检出3个系统误差引起的失控数据,采用单规则质控方法未检出失控。

结论

PCR检测HBV DNA当实验室前20次室内质控数据CV≥10%时,无论采用单规则还是多规则质控方法均不能正确检出失控;实验室应设定自己实验室最低要求的CV,并采用多规则质控方法,以提高系统误差的失控检出率。

关键词: 室内质控; 聚合酶链反应; 乙型肝炎
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2014)06-0668-03
The investigation on the internal quality control of HBV DNA determination by fluorescence quantitation PCR
JIANG Lingli, WANG Xueliang, XIAO Yanqun, WANG Hualiang
Shanghai Center for Clinical Laboratory, Shanghai 200126, China
Fund:
Abstract
Objective

To investigate the internal quality control of hepatitis B virus (HBV) DNA determination by real time fluorescence quantitation polymerase chain reaction (PCR).

Methods

The coefficients of variation (CV) of previous 20 internal quality control data of HBV DNA determination under routine condition from PCR laboratories in Shanghai region were analyzed, and the control chart was drawn by the mean(x-±s).13s/22s multi-rule quality control method and Levey-Jennings single-rule quality control method were used to determine internal quality control data from laboratory A,B and C whoseCV were ≥10%,5%-<10% and 1%-<5%, respectively.

Results

When the concentrations of the internal quality control materials were 5×104 and 5×106 IU/mL, there were no error data detected in laboratory A whoseCV were 14.96% and 12.15% by 13s/22s multi-rule quality control method and Levey-Jennings single-rule quality control method, respectively. There were both 2 random error data detected in laboratory B whoseCV were 6.49% and 5.00% by 13s/22s multi-rule quality control method and Levey-Jennings single-rule quality control method, respectively. TheCV of laboratory C were 4.36% and 2.43%. There were 3 systematic error data detected by 13s/22s multi-rule quality control method, and there were no error data detected by Levey-Jennings single-rule quality control method.

Conclusions

When theCV of the previous 20 internal quality control data were ≥ 10%, the error detections are all low both by the multi-rule quality control method and single-rule quality control method. The laboratory should set the suitableCV and use the multi-rule quality control method to improve the systematic error detection.

Keyword: Internal quality control; Polymerase chain reaction; Hepatitis B virus

实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是国内乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)检测应用最广泛的方法。检测结果直接影响临床治疗效果的监测,故其质量控制工作尤其重要。其中室内质量控制(IQC)是确定测定结果是否可靠、可否发出报告的一项重要措施[ 1]。实验室通常采用在常规条件下,每批检测一次质控品,共检测20批次,由这20次数据计算出常规条件下的变异;然后以测出来的均值(x- ±s)和不精密度( CV)绘制质控图,将以后每次测得的质控数据绘制在质控图上,判断是否失控,这也是我们常说的统计学质量控制。上海地区PCR实验室测定HBV DNA的室内质量控制即采用此方法。由于国内PCR测定HBV DNA主要依靠手工进行核酸提取,整个操作步骤繁多,其检测结果差异大,前20次检测数据测得的x-和 CV大小将影响室内质控结果的判断。我们收集2013年上海市实验室PCR检测HBV DNA的室内质控数据,并对其中3家实验室在不同 CV范围内的室内质控数据进行分析,探讨适合实验室的PCR测定HBV DNA的室内质控方法。

材料和方法
一、上海市各PCR实验室检测HBV DNA项目前20次室内质控数据的 CV

1. 收集所有2013年上海市开展HBV DNA项目的PCR实验室的室内质控数据。

2. 统计PCR实验室检测HBV DNA项目的前20次室内质控数据(剔除室内质控数据个数<20个的实验室),计算质控品浓度分别为5×104 IU/mL和5×106 IU/mL时各实验室采用PCR检测HBV DNA的 CV。

二、选择、统计分析3家PCR实验室在不同 CV范围内的室内质控数据。

1. 对PCR实验室分别按前20次室内质控数据 CV≥10%、5%~<10%和1%~<5%进行分组。通过室内质控软件,筛选出质控数据≥20个(不包括前20个数据)的实验室。

2. 在满足筛选条件的实验室中,分别在不同 CV范围内随机抽取1家实验室。然后收集这3家PCR实验室的2013年所有室内质控数据,分别统计3家实验室前20次室内质控数据的均值(x- ±s)、标准差( s)和 CV。并按 CV≥10%、5%~<10%和1%~<5%标记为A、B和C实验室。

3.采用13 s/22 s的多规则质控方法,通过质控软件判断3家实验室的室内质控数据。

4.采用Levey-Jennings单规则质控方法,通过质控软件判断3家实验室的室内质控数据。

5. 根据室内质控判断结果,结合实验室原始数据的曲线,分析3家实验室的失控数据。

三、统计学方法

采用EXCEL 2003软件进行统计分析。所有统计均将初始浓度值QDNA进行对数转化为log值(LGQ)后计算。统计结果小数点后保留2位有效数字。

结果
一、收集开展HBV DNA检测的各PCR实验室的室内质控数据

统计各实验室前20次室内质控数据的 CV,计算在质控品浓度分别为5×104 IU/mL和5×106 IU/mL时不同 CV范围下的实验室家数及比例,结果见表1。

表1 2013年上海地区各实验室HBV DNA项目室内质控前20次数据统计[实验室数(%)]
二、收集 CV分别为≥10%,5%~<10%和1%~<5%范围的3家实验室的室内质控数据

统计室内质控品浓度预期值分别为5×104 IU/mL和5×106 IU/mL时前20次数据的x- ±s、 s、 ±2 s范围和 ±3 s范围。结果见表2。

表2 不同 CV范围的实验室HBV DNA项目质控限统计
三、3家实验室室内质控数据分析

分别采用13s/22s的多规则质控方法和Levey-Jennings单规则质控方法分析3家实验室的室内质控数据。结果见图1和表3。

图1 采用13s/22s的多规则质控方法室内质控图

表3 采用13s/22s的多规则质控方法失控数据分析
讨论

临床PCR检验与其他临床检验一样,产生的误差有两类,包括系统误差和随机误差[ 1]。IQC工作的第一步就是要确定好检测项目的允许总误差(TEa),这是做好IQC工作的前提或基础。将室内质控允许范围定的太窄,假失控率高,势必会浪费资源;定的太宽,假在控率高,会误导临床诊断和治疗[ 2]。目前,国内PCR测定HBV DNA均采用外标法,受模板浓度、PCR反应体系的批间差异影响大;有学者提出必须进行方法学的 CV分析,以此来规范PCR实验室的IQC工作[ 3]。那么多大的 CV在PCR测定HBV DNA项目中是合理的呢?从表1结果显示,前20个室内质控检测数据中各有94.44%的实验室在两个质控品理论浓度为5×104 IU/mL和5×106 IU/mL时的 CV均在10%以下。我们也统计了2013年上海地区2次室间调查和2次飞行检查的数据,剔除有系统偏差的不合格医院的数据后,所有调查品结果的 CV均在10%以下(数据未在文中列出)。相关文献报道[ 4, 5]的PCR测定HBV DNA的 CV也在10%以内。根据统计学理论,定量检验的室内质控,是根据20次独立批次测定的质控结果计算出平均数(x- ±s)和 s,再根据 s设定质控限值进行质控判断的。从表2可以看出,实验室A在质控品浓度为5×104 IU/mL和5×106 IU/mL时,其高、低值质控品±2 s和 ±3 s范围均超过了两个数量级以上,此范围已远超出临床医师的可接受范围。从之后的质控分析看出,无论采用13 s/22 s的多规则质控方法还是Levey-Jennings单规则质控方法,实验室A均未检出一个失控。但进一步分析实验室A的室内质控数据,发现其低值质控最低为3.24×102 IU/mL(已低于系统的检测下限),最高为2.85×105 IU/mL,高值质控最低为2.42×104 IU/mL,最高为3.77×107 IU/mL;分析实验的原始数据发现,其校准曲线提示实验的扩增效率和相关系数均不佳,已是明显的失控;但由于质控范围过宽,未能检出失控。这些检测结果就有可能给临床医师对患者的治疗方案带来误导。按上海地区室内质控要求,PCR测定HBV DNA用于绘制质控图的前20个质控数据的 CV必须小于10%。但随着检测系统的优化以及不同实验室的实际情况,不同实验室可以设定自己的最低 CV要求。

Levey-Jennings质控图是临床检验中最简单和最常用的质控方法,其质控规则仅为单独的12s或13s来判断分析批在控或失控。Westgard等人在Levey-Jennings质控的基础上,建立使用多个规则来进行临床检验质控的方法[ 6]。其中13s对随机误差敏感,22s对系统误差敏感。实验室B在质控品浓度为5×104 IU/mL和5×106 IU/mL时,其前20次质控数据的 CV分别为6.49%和5.00%,通过室内质控软件分别采用13s/22s的多规则质控方法和Levey-Jennings单规则质控方法,从图1和表3可以看出,均在第32和36次检出了失控。结合当日的标准曲线分析,第32次实验的扩增效率(E)为57.06%,第36次实验的E为74.87%,通常PCR实验E的范围在90%~110%,实验室B的两次扩增效率超过了3%以上范围。因此,这两次失控为真失控,并为随机误差引起。分析实验室C的室内质控数据,分别采用13s/22s的多规则质控方法和Levey-Jennings单规则质控方法,采用13s/22s的多规则质控方法共检出3次22s失控,而采用Levey-Jennings单规则质控方法未检出失控。结合实验室C这3次当日的标准曲线分析,E为97.63%~104.89%,分析阈值和 r均在可接受范围内;从质控图观察,实验室质控数据从第22次检测起开始偏低,并且直至第48次检测,整个检测数据全部偏于中心线下方。所以可以确定这3次失控均为系统误差引起的失控。但如果实验室采用的是Levey-Jennings单规则质控方法,这种由系统误差引起的失控将不会被发现。系统误差是由预知的原因引起的,如更换检测方法学、更换仪器、更换试剂和环境改变等。而通过进一步分析,实验室C在第22次检测起更改了试剂品牌,由此确定实验室C的3次失控均是由于试剂更换引起的系统误差。通常在更换检测系统后,实验室应该对实验检测数据进行重新初始化,并重新计算 s值设置质控限,并对后面的检测数据重新进行质控判断。

综上所述,PCR测定HBV DNA室内质控的初始化 CV在10%以上时,会导致无法正确检出失控。当 CV在10%以下时,采用Levey-Jennings单规则质控方法,会导致系统误差漏检。故我们认为PCR测定HBV DNA的室内质控工作必须进行 CV分析,设定实验室最低的 CV要求,并且建议采用多规则的质控方法。但具体规定多少为允许的 CV和采用哪几个多规则质控规则还应根据各实验室的情况,并通过大量的数据去进一步验证后确定。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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[2] 杨振华. 室内质控是实验室质量管理的基础[J]. 检验医学, 2004, 19(1): 1-5. [本文引用:1]
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[4] 祁金友, 樊 卫. 实时荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒DNA室内质控累积数据的评价[J]. 检验医学与临床, 2011, 8(15): 1845-1846. [本文引用:1]
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[6] 申子瑜. 医院管理学临床实验室管理分册[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2003: 148-149. [本文引用:1]