引用本文
张国栋, 王莹, 朱红胜. 临床分离的美罗培南和环丙沙星共同耐药的铜绿假单胞菌耐药机制的研究. 检验医学2014, 29(6):646-650
ZHANG Guodong, WANG Ying, ZHU Hongsheng. Research on the drug resistance mechanisms of meropenem and ciprofloxacin in clinical isolates ofPseudomonas aeruginosa . Labratory Medicine, 2014, 29(6):646-650  
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临床分离的美罗培南和环丙沙星共同耐药的铜绿假单胞菌耐药机制的研究
张国栋1, 王莹2, 朱红胜1
1. 南京医科大学附属苏州医院,苏州市立医院(东区)检验科,江苏 苏州 215001
2. 南京市浦口区疾病预防控制中心,江苏 南京 210031

通讯作者:朱红胜, 联系电话:0512-62364338

作者简介:张国栋,男,1981年生,学士,主管技师,主要从事临床微生物检验工作。

摘要
目的

探讨临床分离的对美罗培南和环丙沙星均耐药的铜绿假单胞菌的耐药机制。

方法

收集经VITEK-2 Compact微生物分析系统检测为美罗培南和环丙沙星耐药的铜绿假单胞菌30株,琼脂稀释法复查最小抑菌浓度(MIC)值。改良三维试验检测碳青霉烯酶,聚合酶链反应(PCR)扩增耐药基因,逆转录PCR 分析细菌外排系统表达情况。

结果

琼脂稀释法与VITEK-2 Compact微生物分析系统检测结果相同。所有菌株均未产碳青霉烯酶,PCR扩增测序未发现基因改变,逆转录PCR检测外排系统发现以mexX和mexC基因表达增加为主,其调控基因扩增测序发现4株mexC过度表达的调控基因nfxB Gly→Val(GGC→GTC),6株mexX过度表达的调控基因mexZ Val→Gly(CTG→CAG)。

结论

外排系统调控基因突变而引起的外排系统MexXY-OprM和MexCD-OprJ过度表达是引起美罗培南和环丙沙星耐药的主要原因。

关键词: 铜绿假单胞菌; 耐药机制; 美罗培南; 环丙沙星; 外排系统
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2014)06-0646-05
Research on the drug resistance mechanisms of meropenem and ciprofloxacin in clinical isolates ofPseudomonas aeruginosa
ZHANG Guodong1, WANG Ying2, ZHU Hongsheng1
1. Department of Clinical Laboratory, the Affiliated Suzhou Municipal Hospital(East-Section) of Nanjing Medical University, Jiangsu Suzhou 215001, China
2. Pukou District Center for Disease Control and Prevention, Jiangsu Nanjing 210031, China
Abstract
Objective

To investigate the drug resistance mechanisms of both meropenem and ciprofloxacin in clinical isolates ofPseudomonas aeruginosa.

Methods

A total of 30 isolates ofPseudomonas aeruginosa which had been tested resistance to both meropenem and ciprofloxacin by VITEK-2 Compact were collected. Agar dilution method was used to reexamine the minimal inhibitory concentrations (MIC) of meropenem and ciprofloxacin. Carbapenemases were detected by modified three-dimensional test. The resistance genes were analyzed by polymerase chain reaction (PCR) amplification. The expression of efflux systems was analyzed by reverse transcription PCR.

Results

The same results were showed between agar dilution method and VITEK-2 Compact. Carbapenemases were not detected by modified three-dimensional test. The overexpression ofmexX andmexC genes were detected by reverse transcription PCR. The sequencing of regulatory genes showed that there were 4 isolates which the Gly(GGC) ofnfxB was substitute for Val(GTC) and 6 isolates which the Val(CTG)ofmexZ was substitute for Gly (CAG).

Conclusions

The overexpression of the MexXY-OprM and MexCD-OprJ efflux system, due to the mutation of regulatory genes of efflux system, is contributed to the drug resistance to both meropenem and ciprofloxacin ofPseudomonas aeruginosa.

Keyword: Pseudomonas aeruginosa; Drug resistance mechanism; Meropenem; Ciprofloxacin; Efflux system

铜绿假单胞菌是医院获得性感染最常见的致病菌之一,其耐药率也逐年上升。碳青霉烯类的美罗培南以及喹诺酮类药物环丙沙星均是治疗其感染的主要药物之一。据国外研究报道,引起铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物耐药的主要机制是碳青霉烯酶的产生、外膜蛋白缺失和外排系统的过度表达等[ 1]。对喹诺酮类药物的耐药机制也包括耐药基因的突变和外排系统的表达[ 2]。本研究是对临床上出现的对亚胺培南敏感而对美罗培南和环丙沙星同时耐药的铜绿假单胞菌耐药机制的分析。

材料和方法
一、材料

1. 菌株来源 收集2012年3至12月苏州市立医院各临床科室分离的30株铜绿假单胞菌(编号:1~30,无重复标本),经VITEK-2 Compact微生物分析系统(法国生物梅里埃公司)鉴定,GN-13药物敏感性卡检测表型为亚胺培南敏感,美罗培南和环丙沙星耐药。质控菌株为铜绿假单胞菌(ATCC 27853)、肺炎克雷伯菌(ATCC 700603)[产超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum beta-lactamase, ESBLs)株]。

2. 试剂和仪器 亚胺培南(默沙东公司,美国)、美罗培南(住友制药株式会社,日本)、头孢他啶(葛兰素史克公司)、 头孢吡肟(中美上海施贵宝制药有限公司)、环丙沙星(朗致集团万荣药业有限公司)、阿米卡星(丽珠医药集团股份有限公司)、克拉维酸(江西制药厂原料药);水解酪蛋白胨琼脂、药物敏感性纸片和LB培养基(Oxoid公司);Taq DNA聚合酶、dNTPS为TaKaRa公司产品;Mastercyler gradient 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增仪(Eppendorf公司);RNAiso Plus(D9108A)总RNA提取试剂盒(TaKaRa公司);iScriptTM cDNA Synthesis Kit和iTaqTM Universal SYBRGreen Supermix(Bio-Rad,美国),801凝胶电泳图像分析系统(捷达公司),Bio-rad电泳系统(美国),ABI 7500 real-time PCR system(ABI,美国)。

二、方法

1. 药物敏感性试验 按美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)(2012版)标准用琼脂稀释法检测和判读菌株对亚胺培南、美罗培南、环丙沙星、头孢他啶、 头孢吡肟和阿米卡星的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)值。

2. 改良三维试验 反复冻融法制备酶粗提取液,以亚胺培南、美罗培南为底物检测碳青霉烯酶,将新鲜培养的大肠埃希菌(ATCC 25922)用生理盐水调至0.5麦氏单位,均匀涂布水解酪蛋白胨琼脂平板,平板中央贴测试药物敏感性纸片。距药物敏感性纸片边缘5 mm处用无菌刀片由内向外放射状切割4个10 mm × 2 mm长的槽。用微量加样器分别吸取ddH2O 40 mL(空白对照)、ddH2O 36 μL和4 μL 200 μg/mL 克拉维酸(对照)、酶粗提液36 μL和ddH2O 4 μL(酶活性检测)、酶粗提液36 μL和克拉维酸 4 μL(酶活性抑制检测)加入各自的检测槽。判定标准:35 ℃培养18 h,铜绿假单胞菌(ATCC 27853)和肺炎克雷伯菌(ATCC 700603)为阴性对照,铜绿假单胞菌产IMP-1型金属酶为阳性对照。若酶活性检测槽与抑菌圈交界处出现向内凸起的细菌生长区即为三维试验阳性;与酶活性检测槽的细菌生长区相比,若酶活性抑制检测槽与抑菌圈交界处细菌生长区缩小即为酶抑制试验阳性[ 3]。

3. 泵抑制剂CCCP对抗菌药物MIC的影响 采用琼脂稀释法测定耐药铜绿假单胞菌加入CCCP前后对美罗培南和环丙沙星的MIC。试验组在琼脂平皿中加入CCCP的终浓度为5 mg/L[ 4],同时加入相同量的CCCP溶解液(蒸馏水)为对照组。比较加入CCCP试验组和蒸馏水对照组前后菌株对2种抗菌药物MIC值的变化,MIC降低为原值的1/4或更低则判断为外排泵阳性菌株[ 5]。

4. 喹诺酮类耐药基因及外排系统调控基因扩增与测序 对喹诺酮类药物耐药基因 gyrA、parC和外排系统过度表达菌株外排泵基因的调控基因 nfxB( mexC)、 mexZ( mexX)进行扩增测序,以煮沸法提取细菌DNA,使用的引物见表1,由上海Invitrogen公司合成,反应体系50 μL,按试剂盒说明加引物和检测试剂,94 ℃预变性5 min后,按94 ℃30 s、退火温度为53 ℃ parC退火温度为54 ℃,72 ℃1 min,共30个循环,72 ℃延伸10 min,产物长度 gyrA 227 bp、 parC 363 bp,送上海Invitrogen公司测序,测序结果与GenBank数据库上 gyrA、parC基因对比。

5. 外排系统基因表达量检测 随机选取10株细菌,采用逆转录实时定量PCR检测 mexA、mexC、mexE和 mexX 4种外排基因的表达量。方法如下:用日本TaKaRa公司的RNAiso Plus试剂盒,按说明书操作提取细菌的总RNA,再使用Bio-RAD公司的iScriptTM cDNA Synthesis Kit试剂盒,按说明书进行总RNA逆转录成cDNA,采用iTaqTM Universal SYBRGreen Supermix试剂盒在ABI 7500 real-time PCR system定量分析外排系统4种基因mRNA的表达量。所用引物(由上海英骏公司合成)见表1,铜绿假单胞菌(ATCC 27853)为正常对照组, rspl基因为内参基因。反应体系20 μL,按试剂说明书进行加样和设置PCR反应条件。

表1 本试验采用的引物
三、统计学方法

使用SPSS 16.0软件进行统计,用配对 χ2检验分析美罗培南和环丙沙星使用CCCP前后铜绿假单胞菌对美罗培南和环丙沙星的耐药率间的差异,以 P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、MIC检测

30株铜绿假单胞菌经琼脂稀释法复查,与VITEK-2 Compact微生物分析系统鉴定和GN-13药物敏感性卡检测结果相同,对亚胺培南敏感,美罗培南和环丙沙星耐药。加入CCCP抑制剂的美罗培南试验组外排泵阳性菌株为17株,对照组均为阴性,两组差异有统计学意义( χ2=13.367, P<0.05);加入CCCP抑制剂的环丙沙星试验组外排泵阳性菌株为22株,对照组均为阴性,两组差异有统计学意义( χ2=16.588, P<0.05)。见表2。

表2 铜绿假单胞菌体外药物敏感性试验(MIC值)结果
二、碳青霉烯酶的检测

以亚胺培南、美罗培南为底物的改良三维试验结果显示,30株铜绿假单胞菌均不产生分解底物的碳青霉烯酶。

三、耐药基因扩增及测序结果

30株铜绿假单胞菌均扩增出 gyrA、parC基因,琼脂糖电泳结果见图1,并对测序结果分别与 gyrA(gene ID: 882800)和 parC(gene ID: 879741)基因比对,未发现有基因改变。

图1 parC、gyrA琼脂糖电泳图谱

四、外排系统基因表达

随机选取10株铜绿假单胞菌进行外排系统基因表达量检测,结果显示以 mexX和 mexC基因表达量增加为主,其他外排系统表达个别增加。见表3。

表3 外排系统表达情况
五、外排系统调控基因扩增测序结果

对进行逆转录实时定量PCR的10株铜绿假单胞菌中表达量超过5倍的菌株进行调控基因的扩增和测序,发现4株mexC过度表达的调控基因 nfxB在碱基位点328处发生点突变(G→T),相应氨基酸(Gly改变为Val。6株 mexX过度表达的调控基因 mexZ测序发现在基因碱基位点489处发生点突变(T→A),相应氨基酸(Val)变为Gly。

讨论

本试验选用耐药型特殊的铜绿假单胞菌作为研究对象,对亚胺培南敏感,对美罗培南和环丙沙星轻中度耐药。据国内外报道,铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要机制是碳青霉烯酶的产生以及外膜蛋白OprD缺失和减少,而对美罗培南耐药主要是碳青霉烯酶的产生以及外排系统的过度表达[ 1, 10]。本试验通过改良三维试验证实,所有铜绿假单胞菌均未产碳青霉烯酶,细菌体外药物敏感性试验也证实对亚胺培南敏感,因此可以排除由于碳青霉烯酶而引起的美罗培南耐药。

目前据国内外报道,铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物的耐药机制主要是DNA螺旋酶( gyrA基因)和拓扑异构酶IV( parC基因)发生靶位突变[ 11]以及外排泵MexAB-OprM、MexCD-OprJ、Mex-EF-OprN 和 MexXY-OprM过度表达[ 12]而引起。本试验对所有铜绿假单胞菌的 gyrA和 parC基因进行扩增和测序发现,均可以扩增出目的基因,但测序结果对比未发现存在碱基改变,基本可以排除由于DNA螺旋酶( gyrA)和拓扑异构酶IV( parC)发生靶位突变而引起的环丙沙星耐药。

外排泵MexAB-OprM、MexCD-OprJ、Mex-EF-OprN 和 MexXY-OprM过度表达可以引起环丙沙星的耐药[ 12],但MexAB-OprM和MexXY-OprM过度表达也可以引起美罗培南的敏感性下降[ 13, 14]。本试验通过对其中部分菌株的外排泵基因进行逆转录实时定量PCR表达量检测,发现在4种外排系统中,以MexXY-OprM和MexCD-OprJ表达增加为主。同时外排泵抑制试验也证实了这一结论。另外对这2个表达系统的调控基因扩增测序发现,调控基因存在点突变,引起表达的氨基酸发生改变,这可能是引起外排系统过度表达的主要原因。这同时也说明引起美罗培南敏感性下降的原因可能是MexXY-OprM外排系统的过度表达。而在Pasca等[ 2]的研究中也表明,MexXY-OprM和MexCD-OprJ过度表达也是引起环丙沙星敏感性下降的主要原因,本试验与其研究结果基本一致。

本研究结果表明,本试验选择的该耐药型铜绿假单胞菌,外排系统调控基因发生突变而引起的外排系统过度表达是引起美罗培南和环丙沙星耐药的主要原因。

The authors have declared that no competing interests exist.

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