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季修庆, 陆根生, 胡平, 成建, 刘邺, 林颖. 荧光定量PCR检测南京地区孕晚期妇女生殖道B族链球菌的带菌情况. 检验医学2014, 29(6):628-630
JI Xiuqing, LU Gensheng, HU Ping, CHENG Jian, LIU Ye, LIN Ying. Colonization of group BStreptococcus in late pregnancy by fluorescence quantitation PCR in Nanjing area . Labratory Medicine, 2014, 29(6):628-630  
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荧光定量PCR检测南京地区孕晚期妇女生殖道B族链球菌的带菌情况
季修庆, 陆根生, 胡平, 成建, 刘邺, 林颖
南京医科大学附属南京妇幼保健院,江苏 南京 210004

通讯作者:林 颖,联系电话:025-52226309。

作者简介:季修庆,女,1977年生,硕士,副主任技师,主要从事产前优生学的研究。

摘要
目的

了解南京地区孕晚期妇女生殖道中B族链球菌(GBS)的带菌情况。

方法

取本地区9 073例妊娠34~37周孕妇生殖道分泌物,选取500名孕中期(20周~24周)的健康孕妇为对照组,采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测GBS,并对检测结果进行分析。

结果

南京地区孕晚期妇女生殖道GBS总带菌率为4.17%,孕中期妇女总带菌率为5.20%,两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。孕晚期中30~34岁组妊娠妇女带菌率最高(4.77%),与≤24岁组和≥40岁组比较,差异有统计学意义(P<0.05),但与其他各年龄组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

结论

南京地区晚孕期妇女GBS带菌率尚在健康人群带菌率的范围内,但也应加强检测;孕周对孕妇GBS带菌率的影响不大。

关键词: B族链球菌; 孕晚期; 荧光定量PCR; 带菌率
中图分类号:R378.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2014)06-0628-03
Colonization of group BStreptococcus in late pregnancy by fluorescence quantitation PCR in Nanjing area
JI Xiuqing, LU Gensheng, HU Ping, CHENG Jian, LIU Ye, LIN Ying
Department of Prenatal Diagnosis,Nanjing Maternity and Child Health Care Hospital, Nanjing Medical University, Jiangsu Nanjing 21004,China
Abstract
Objective

To evaluate the colonization of group BStreptococcus(GBS) in late pregnancy in Nanjing area.

Methods

The vaginal samples from 9 073 women in late pregnancy(34-37 weeks) were collected. A total of 500 cases of second trimester(20-24 weeks)of healthy pregnant women were chosen as control group. The colonization of GBS was detected by fluorescence quantitation polymerase chain reaction(PCR). The results were analyzed comparatively.

Results

The results showed that the GBS carrier rate in late pregnancy was 4.17%, the carrier rate in second trimester pregnant women was 5.20%, and there was no statistical significance between the 2 groups(P>0.05). The carrier rate of 30-34 years old group was the highest (4.77%), compared with ≤24 years old group and ≥40 years old group respectively, and the difference was statistically significant (P<0.05), but the difference with the other age groups had no statistical significance (P>0.05).

Conclusions

The carrier rate of GBS in late pregnancy is within the range of carrier rate of healthy population in Nanjing area. Gestational weeks have little effect on the pregnant women with GBS carrier rate.

Keyword: Group BStreptococcus; Late pregnancy; Fluorescence quantitation polymerase chain reaction; Colonization carrier rate

B 族链球菌(group B Streptococcus, GBS)是一种β溶血的革兰阳性链球菌,亦称无乳链球菌。GBS寄居于健康人的直肠和阴道,是孕产妇生殖道感染的重要致病菌之一,可导致泌尿系统感染、产褥感染、孕产妇败血症等,与早产、胎膜早破、新生儿早发和晚发型感染(如败血症脑膜炎)等疾患有关[ 1, 2]。由于妊娠期GBS 感染会导致母亲和新生儿的感染,因此,采取积极有效的预防和治疗措施对降低围生期感染具有重要的意义。我们采用实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)快速检测GBS,探讨南京地区孕晚期的孕妇生殖道GBS的携带情况。

材料和方法
一、标本来源

选择2013年1月至11月在南京医科大学附属南京妇幼保健院门诊就诊和住院的妊娠34~37周的健康孕妇,共采集待产孕妇阴道分泌物标本9 073例。年龄20~45岁,其中≤24岁1 062例,25~ 29 岁5 328例,30岁~34岁2 329例,35~39岁325例,≥40岁29例。选取500名妊娠20~24周的健康孕妇作为对照组。生殖道分泌物标本由妇产科医生采集,采样之前遵循所有孕妇知情同意的原则,孕妇在取样前1周受检者未使用任何抗菌药物,取样部位未使用过栓剂和洗液,不作清洁处理,以无菌棉试子涂擦阴道下1/3分泌物及肛周分泌物。

二、仪器与试剂

采用PCR及荧光标记探针技术检测临床标本中GBS特定基因( CAMP),从而判断GBS的存在。试剂盒由泰普生物科学有限公司提供。试剂盒中使用尿嘧啶-N-糖化酶和dUTP,有助于避免扩增产物的污染。阳性对照为含目的基因质粒,目的基因来自美国菌种保藏中心(ATCC)的原始菌株。试剂盒检测下限为1.0×103 copies/mL,线性范围:1.0×108~1.0×103 copies/mL。试剂盒经试验证明不会与临床常见其它各类病原体(白色念珠菌、大肠埃希菌、牛链球菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、肠炎沙门菌、肠球菌等)产生交叉反应。ABI 7500荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。

三、方法

1. 标本处理 在无菌拭子管加入1 mL清洗液,用振荡器高速震荡2 min制成标本悬液,取出全部标本放入1.5 mL离心管中,15 000× g离心5 min,弃上清,加入1 mL清洗液震荡重悬,再重复以上步骤。加入50 μL清洗液重悬,标本管中各加入1管提取固形物,用强力振荡器高速涡旋震荡5 min。各取阴性对照、阳性对照和待测标本于95 ℃干浴2 min,立即冰浴2~5 min后15 000× g离心1 min,上清用于PCR扩增。

2. 加样及PCR扩增 在准备好的PCR反应管中分别加5 μL待测标本和对照品,盖紧管盖后瞬时离心。扩增条件:37 ℃ 2 min,94 ℃ 2 min, 94 ℃ 15 s,55 ℃ 45 s,40个循环。

3. 条件设定和结果分析 取2个循环到样品阈值前3个循环最为基线,阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点,即Ct阴性对照=40或“Undet.”为准。质控标准的阴性和阳性对照同时满足两个条件:阴性对照GBS(FAM,一种TaqMan探针羧基荧光素)Ct值=40或“Undet.”;阳性对照GBS(FAM)<33且有较好的对数增长曲线,否则视为本次试验无效。GBS阴性(低于检测下限):FAM Ct值=40或“Undet.”。GBS阳性:FAM Ct值≤33,且有较好的对数增长曲线。标本的灰度区:FAM 33<Ct<40,试验可能存在系统及人为不确定性因素,样本重复检验确诊。

四、统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。不同孕期组间采用两组样本率的χ2检验。 P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、不同孕期孕妇GBS带菌率

9 073例晚孕期(34~37周)孕妇中共检出GBS携带者377例,带菌率为4.17%;对照组500例中检测26例阳性,带菌率为5.20%。不同孕期之间GBS带菌率差异无统计学意义( P>0.05)。

二、各年龄组孕晚期妇女GBS带菌率

各年龄组晚孕期孕妇GBS带菌率,其中30~34岁组带菌率最高(4.77%),与≤24岁组和≥40岁组比较,差异均有统计学意义( P<0.05),但与其他各年龄组比较差异均无统计学意义( P>0.05),见表1。

表1 各年龄组的孕晚期孕妇GBS带菌率
讨论

早在1933年Laneefield 就提出GBS 可引起人类多种疾病。1938年 Fry首次报道3例患者死于GBS 引起的产后心内膜炎,证实该菌为人的致病菌。70年代之后,GBS所致临床感染尤其在围产期及产科感染逐年增多,西方国家对GBS 所致围生期感染进行了大量研究,并引起世界范围关注[ 1, 2]。由于妊娠期GBS会导致母亲和新生儿的感染,因此,在孕晚期对孕妇进行GBS筛查,对阳性患者采取积极有效的预防和治疗措施,可有效降低围生期感染。在美国,目前已对约90 %的妊娠35~37周的孕妇开展GBS培养筛查,新生儿GBS感染明显下降[ 1]。

细菌培养一直是诊断GBS感染的最经典的常规方法,但耗时较长,操作复杂,从而限制了该技术在临床的应用。虽然GBS血清学检测方法(如乳胶凝集实验、酶联免疫吸附试验协同凝集试验等)具有迅速获得检测结果的特点,但这些方法假阴性率和假阳性率均很高,临床应用也受到限制。分子生物学技术具有敏感性高,检测周期短,检测结果准确稳定,而且操作简便,目前已得到广泛应用于病原体检测[ 3, 4]。荧光定量PCR被认为是检测GBS的快速、准确性高、敏感性高的一种方法[ 5]。

妊娠妇女GBS带菌率在国外不同地区的报道差异很大,如欧洲国家为6.5%~36.0%[ 6],美国为2%~29%,韩国为13%[ 5]。我国目前产妇GBS带菌情况尚不作为常规检查,也无大标本的流行病学资料,但有条件的地区已经在做筛查和诊断性检查。马延敏等[ 7]、鲁炳怀等[ 8]报道北京地区孕妇带菌率分别为11.07%、7.10%;陈慧慧等[ 9]检测上海地区992名孕妇带菌率为3.70%,在国内其他地区的孕妇带菌率报道还有桂林地区7.50%[ 10],南通地区6.20%[ 2],江西地区为8.76%[ 11],河北秦皇岛地区为9.50%[ 12]。本研究采用荧光定量PCR对南京地区的9 073例晚孕期孕妇进行检测,总带菌率为4.17%,稍高于陈慧慧等[ 9]的报道,但低于全国其他地区的报道。孕妇的GBS带菌率受很多因素影响,如检测方法、采集部位、采集时间、种族等,同时还有地域的差异性。本研究结果显示孕中期(妊娠20~24周)孕妇带菌率与孕晚期比较差异无统计学意义( P>0.05),推测孕周对孕妇GBS带菌率影响不大。本研究中30~34岁组孕妇GBS生殖道带菌率最高(4.77%),与≤24岁组和≥40岁组比较,差异有统计学意义( P<0.05),与已报道的育龄妇女生殖道感染的高发年龄[ 13]相似,可能与该年龄段妇女性生活活跃、人工流产史及妊娠期雌激素水平较高等因素导致生殖道细菌的微环境改变有关。另外,本研究40岁以上年龄组未发现GBS阳性者,除与该年龄组孕妇例数较少有关外,推测还可能与雌激素水平降低、性生活相对减少等有关。

综上所述,南京地区孕晚期妊娠妇女GBS 带菌率尚在健康人群带菌率的范围内,但也应加强检测。荧光定量PCR为GBS的快速诊断以及更加准确有效地对孕晚期妇女使用抗菌药物预防GBS感染提供了依据。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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