上海地区健康成年人外周血T淋巴细胞亚群参考区间调查

引用本文

董静懿, 宁小晓, 王蕾, 田建辉. 上海地区健康成年人外周血T淋巴细胞亚群参考区间调查. 检验医学2014, 29(6):617-622
DONG Jingyi, NING Xiaoxiao, WANG Lei, TIAN Jianhui. Investigation on the reference ranges of peripheral blood T lymphocyte subsets among healthy adults in Shanghai. Labratory Medicine, 2014, 29(6):617-622 复制到剪切板

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上海地区健康成年人外周血T淋巴细胞亚群参考区间调查

董静懿¹, 宁小晓¹, 王蕾¹, 田建辉²

1. 上海中医药大学附属龙华医院检验科,上海 200032

2. 上海中医药大学附属龙华医院肿瘤科,上海 200032

通讯作者:王蕾,联系电话021-64385700-3206。

作者简介:董静懿,女,1968年生,学士,主管技师,主要从事流式细胞学研究。

基金:国家自然科学基金资助项目(81173224); 上海中医药大学附属龙华医院龙医学者项目(LHSD-11);

摘要

目的

通过对上海地区333名健康成年人外周血T淋巴细胞亚群计数,调查正常人群T淋巴细胞亚群的参考区间,建立95%可信区间的参考区间,并分析和探讨其变化特点,为机体免疫状态的分析和临床诊疗提供参考。

方法

采用多参数三色免疫荧光标记外周血T淋巴细胞,使用BD FACSCalibur流式细胞仪检测并分析,获得T淋巴细胞亚群的百分比和绝对值。

结果

女性的CD3⁺ 百分比、CD4⁺ /CD8⁺比值、CD3⁺ CD4⁺ 百分比和CD4⁺CD45RA⁺百分比分别为(72.6%±8.1%)、1.57(0.74~4.70)、(44.8%±8.0%)和(1.71%±6.3%),均高于男性分别为(70.9%±8.5%)、1.43(0.51~4.12)、(40.6%±9.3%)和(15.1%±6.8%)。男性的淋巴细胞绝对值计数、CD8⁺CD28⁺的绝对值计数分别为(2 069.8±474.1)个/μL、(237.5±95.7)个/μL,均高于女性(1 932.8±469.7)个/μL、(218.1±111.1)个/μL。T淋巴细胞亚群的百分比在不同年龄组之间随年龄增大而发生变化,年龄相差越大,差异越大,其中>50岁组与其他组别比较差异有统计学意义。333名健康成年人外周血淋巴细胞绝对值计数为(1 069.1~2 935.6)个/μL,T淋巴细胞亚群百分比计数为:CD3⁺ 细胞55.3%~87.6%,CD3⁺ CD4⁺ 细胞25.2%~57.6%,CD3⁺ CD8⁺细胞15.0%~42.1%,CD4⁺CD25⁺细胞2.5%~10.5%, CD4⁺CD45RA⁺细胞5.0%~27.2 %,CD8⁺CD28⁺细胞4%~19.3%,CD4⁺ /CD8⁺ 比值0.7~2.9。

结论

健康成年人T淋巴细胞亚群的百分比分布存在性别和年龄差异,由于这种差异不大,可以合并数据建立上海地区健康成年人外周血T淋巴细胞亚群的参考区间。

关键词: 流式细胞术; 正常参考值; T淋巴细胞亚群

中图分类号:R446.63 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2014)06-0617-06

Investigation on the reference ranges of peripheral blood T lymphocyte subsets among healthy adults in Shanghai

DONG Jingyi¹, NING Xiaoxiao¹, WANG Lei¹, TIAN Jianhui²

1. Department of Clinical Laboratory, Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China

2. Department of Oncology, Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China

Fund:

Abstract

Objective

To establish the reference ranges of peripheral blood T lymphocyte subsets among 333 healthy adults in Shanghai, to analyze and discuss the change characteristics through the establishment of 95% confidence interval, and to provide the reference for immune status analysis and clinical diagnosis and treatment.

Methods

Multiparameter three-color immunofluorescence was used to stain the peripheral blood T lymphocytes, and BD FACSCalibur flow cytometry was used to acquire and analyze the percentages and absolute counts of T lymphocyte subsets.

Results

Among females, the CD3⁺ percentage, CD4⁺/CD8⁺ ratio, CD3⁺ CD4⁺ percentage and CD4⁺CD45RA⁺ percentage (72.6%±8.1%), 1.57(0.74-4.70), (44.8%±8.0%) and (1.71%±6.3%) were respectively higher than those among males (70.9%±8.5%), 1.43(0.51-4.12), (40.6%±9.3%) and (15.1%±6.8%). The lymphocyte absolute count and CD8⁺CD28⁺ absolute count in males (2 069.8±474.1) cells/μL and (237.5±95.7) cells/μL were higher than those in females (1 932.8±469.7) cells/μL and (218.1±111.1) cells/μL. The percentage of T lymphocyte subsets increased with the increase of age. There were statistical significances in >50 year-old group with the other groups. The absolute count of 333 healthy adults for peripheral blood T lymphocyte was (1 069.1-2 935.6) cells/μL. The percentages of T lymphocyte subsets were: CD3⁺ 55.3%-87.6%, CD3⁺CD4⁺ 25.2%-57.6%, CD3⁺CD8⁺ 15.0%-42.1%, CD4⁺CD25⁺ 2.5%-10.5%, CD4⁺CD45RA⁺ 5.0%-27.2 % and CD8⁺CD28⁺ 4%-19.3%, and CD4⁺/CD8⁺ ratio was 0.7-2.9.

Conclusions

There are differences for the percentage distribution of T lymphocyte subsets among healthy adults between sex and age. Since these differences can be ignored, the reference ranges of peripheral blood T lymphocyte subsets among healthy adults could be established in Shanghai.

Keyword: Flow cytometry; Normal reference range; T lymphocyte subset

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T淋巴细胞亚群在免疫系统中起重要作用,其失调会导致感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤、免疫缺陷病等多种疾病,其中CD4⁺的百分含量和绝对值及CD4⁺/CD8⁺比值可作为获得性免疫缺陷综合征 ( acquired immunedeficiency syndrome, AIDS) 、白血病和淋巴瘤研究和治疗的重要参考依据^{[ 1, 2]}。近年来的研究表明,恶性肿瘤患者免疫功能低下以及判断治疗的有效性都与活化的T辅助细胞CD4⁺CD25⁺、CD8⁺CD28⁺(细胞毒T细胞)百分含量高低有密切关系^{[ 3, 4, 5, 6]}。国内外对CD3⁺ 、CD3⁺ CD4⁺ 、CD3⁺ CD8⁺ 、CD4⁺ /CD8⁺ 报道较多^{[ 7, 8, 9]},而对CD4⁺CD25⁺、CD4⁺CD45RA⁺、CD8⁺CD28⁺ 3种T淋巴细胞免疫表型的大样本量的研究不多,由于不同实验室所用的流式细胞仪不同、试剂不同、对试验数据进行统计的方法不同,国内目前没有统一的T淋巴细胞亚群的正常参考值范围,因而很有必要建立本地区、本实验室的T淋巴细胞亚群的参考区间,以供基础研究和临床诊治参考。

材料和方法

一、研究对象

333例样本取自上海市常住人口,于2012年2至12月来龙华医院进行单位体检的成年人,年龄19~85岁,平均年龄36.4岁,男169名,女164名。体格健康,无现病史,全血细胞计数及肝、肾功能检查正常,有人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋体等感染者和免疫系统疾病患者排除。

二、样本采集

样本均在上午7:00~9:00采集,使用乙二胺四乙酸三钾抗凝采血管(美国BD公司)采集静脉血3 mL,立刻进行白细胞计数和白细胞中淋巴细胞百分率的测定,计算出淋巴细胞绝对值,剩余的样本随后立即进行流式细胞仪检测样本的制备。6 h内进行样本处理并检测。

三、主要试剂和仪器

BD FACSCalibur流式细胞仪。荧光抗体:三色CD4-藻红蛋白(phycoerythrin, PE)/CD8-异硫氰酸荧光素(flurescein isothiocyanate, FITC)/CD3-多甲藻黄素(peridinin chlorophyll protein complex, PerCP),CD4-FITC单抗,CD25-PE单抗,CD4-PE单抗,CD45RA-FITC单抗,CD8/CD28双抗、CD3/CD16+56双抗。FACS 溶血剂和TruCOUNT绝对计数管均为美国Becton Dickinson公司产品。全血质控品1为IMMUNO. TROLll Cells(批号7587045),全血质控品2为IMMUNO. TROLll^TM Low Cells(批号7609057),均由上海市临床检验中心提供(美国Beckman Coulter公司产品)。

四、样本制备和检测

1. 在BD记数管中准确加入10 μL三色荧光试剂和50 μL全血,充分混匀后置室温(20~25 ℃)避光孵育15~30 min。加入450 μL FACS溶血液,充分混匀后室温阴暗处15 min,4 ℃避光保存,2 h内上机检测。

2. 在检测之前,先启动FACSComp软件,对仪器用CaliBRITE Beads试剂进行校准调试。取试剂盒中的未标记试剂1滴加入第1支试管,加入鞘液1 mL,混匀;取4种试剂(FITC、PE、PerCP、Unlabeled)各1滴加入第2支试管,加入鞘液2 mL,混匀。然后进行仪器的校准,检查流式细胞仪的光路和液路,确定其变异系数(coefficient of variation, CV)<2% 。用FITC-IgG1/PE-IgG1/PEcy5-IgG1同型阴性对照管设立荧光染色阴阳分界线, 然后进行T淋巴细胞亚群的检测。运行CELLQUEST程序,检测时,每个样本测定管至少取淋巴细胞数10 000个,保证门内包括97%以上的淋巴细胞,单核细胞不超过3%。每次试验均加入质控品1和2,并保证每次质控结果均在 ±s内,每次检测均使用质控品同时检测。

五、统计学方法

采用SPSS 10.5软件包进行统计分析。对于正态分布数据用 ±s表示,两组间比较采用 t检验,多组比较采用方差分析和 q检验。对于非正态分布数据用中位数(范围)表示,采用秩和检验进行统计。以95%可信区间建立各指标的参考区间。以 P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、不同性别淋巴细胞绝对值和百分比比较

对数据进行正态性检验,CD3⁺、CD3⁺ CD4⁺、CD3⁺ CD8⁺、CD4⁺CD45RA⁺ 的绝对值和百分比及CD8⁺CD28⁺的绝对值呈正态分布,CD4⁺ /CD8⁺、CD4⁺CD25⁺的绝对值和百分比及CD8⁺CD28⁺的百分比呈偏态分布。淋巴细胞绝对值、CD8⁺CD28⁺绝对值男性大于女性,差异有统计学意义;CD3⁺、CD3⁺CD4⁺的百分比、CD4⁺/CD8⁺比值女性大于男性,差异有统计学意义;CD4⁺CD45RA⁺的百分比女性大于男性,差异有统计学意义。见表1。

表1 不同性别研究对象间T淋巴细胞亚群检测结果比较(绝对值:个/μL;百分比:%)

二、不同年龄组T淋巴细胞亚群百分比的比较

将研究对象按照年龄分为4组,Ⅰ组为19~29岁,Ⅱ组为30~39岁,Ⅲ组为40~49岁,Ⅳ组为≥50岁,具体结果见表2。随年龄增大有逐渐下降趋势的指标有:CD3⁺ 、CD3⁺ CD8⁺、CD4⁺CD45RA⁺、CD8⁺CD28⁺ ;逐渐上升的有:CD3⁺ CD4⁺、CD4⁺ /CD8⁺、CD4⁺CD25⁺;Ⅰ组的CD4⁺CD45RA⁺与其他3组均有差异,而其他三组之间差异无统计学意义,说明19~29岁者的CD4⁺CD45RA⁺含量较高;第Ⅳ组的CD8⁺CD28⁺ 百分比与其他三组差异有统计学意义,第Ⅳ组CD3⁺CD4⁺百分比、CD3⁺CD8⁺百分比、CD4⁺/CD8⁺比值、CD4⁺CD25⁺百分比与Ⅰ组、Ⅱ组比较差异有统计学意义。

表2 不同年龄组间T淋巴细胞亚群的百分比比较

三、T淋巴细胞亚群参考区间

本研究采用国际临床实验室标准化委员会推荐的95%可信区间以正态分布法和百分位数法相结合的方法确定正常人T淋巴细胞亚群的参考区间,见表3。

表3 健康成人外周血T淋巴细胞亚群检测结果及参考区间(绝对值:个/μL;百分比:%)

讨论

T细胞产生于胸腺,骨髓造血干细胞的T细胞前体在胸腺基质细胞和细胞因子的作用下,分化成有功能的T淋巴细胞,数百万个带有对不同抗原特异性受体的T细胞都是由多种遗传的种系基因经基因重排而产生的^{[ 10]}。在胸腺中产生的每个T细胞都只有一种由其抗原受体编码的特异性,T淋巴细胞由于遗传性而具有个体差异。免疫系统受年龄、性别、遗传的影响,导致每个个体的T淋巴细胞亚群既具有地域、人种、个体的差异,也受性别、年龄的影响而又有变化,这在本次研究中都得到再次论证。

本研究选取了上海地区333例来龙华医院体检的健康成年人样本,检测CD3⁺ 、CD3⁺ CD4⁺ 、CD3⁺ CD8⁺、CD4⁺ /CD8⁺ 、CD4⁺CD25⁺、 CD4⁺CD45RA⁺ 、 CD8⁺CD28⁺的绝对值和百分比,旨在建立本地区正常参考区间,也为临床和科研提供正常人外周免疫基线数据。通过对研究结果的统计学分析发现,CD3⁺ 、CD3⁺ CD4⁺ 、CD4⁺ /CD8⁺、 CD4⁺CD45RA⁺的百分比表现为女性高于男性,与文献[1-2,7]相符。近年有学者注意到免疫活性细胞的比例存在着性别差异^{[ 10]},可能的原因是女性有淋巴样组织分布在整个生殖道内,而除此之外,两性淋巴组织的解剖学分布都是相同的,所以这似乎可以用来解释女性的CD3⁺ 、CD3⁺ CD4⁺ 比男性高的遗传机制,当然这个机制的负面结果是女性的自身免疫性疾病的发病率明显高于男性。

本研究T细胞亚群的结果随年龄变化很明显,其中CD3⁺ CD8⁺、CD4⁺ /CD8⁺、CD4⁺CD25⁺、CD4⁺CD45RA⁺、CD8⁺CD28⁺的变化与年龄的关系尤为密切,年龄相差越大,差异越大。原因一,免疫衰老的进程非常复杂,T 细胞改变是最重要的特征。免疫衰老的重要进程包括:T细胞受体基因多态性减少、记忆/效应T 细胞蓄积、胸腺退化、初始T细胞(CD4⁺CD45RA⁺)耗竭以及慢性炎性衰老^{[ 11, 12]};原因二,CD4⁺和CD8⁺细胞的端粒长度随着年龄的变化而变化^{[ 13]}, 端粒长度和端粒酶表达的深层次原因有待更深入的研究。在本研究中,我们通过年龄组的比较发现在最年轻的Ⅰ组(19~29岁)中CD4⁺CD45RA⁺显著高于其他年龄组,可能的解释是初始T细胞CD45RA⁺在抗原刺激下发生增殖反应,其表面CD45RA表达下降,从具有免疫抑制作用的原始T淋巴细胞(未致敏T细胞)转化为具有辅助诱导作用的记忆T细胞^{[ 14]}。而CD4⁺CD45RA⁺在某些病毒感染性疾病的进展期数量下降,而当接受抗病毒治疗后其数量又会增加;在活动性多发性硬化症中,其表达下降,许多变态反应性疾病患者外周血中 CD4⁺CD45RA⁺T细胞所占比例高于正常人,建议临床诊治这类疾病时应考虑到年龄因素所造成的差异。

CD4⁺CD25⁺作为活化的辅助性T细胞,在20世纪末刚出现时,被认为是具有调节功能的T细胞亚群,一段时间曾被命名为Treg 细胞。随着研究的深入,发现Treg细胞最理想的表面标志是CD4⁺CD25⁺CD127^low或CD4⁺CD25⁺Foxp3^{[ 15, 16, 17]}。动物实验模型中发现CD4⁺CD25⁺细胞能增强自然杀伤细胞杀死肿瘤的能力^{[ 16]},Kayser等^{[ 4]}和Karagöz等^{[ 6]}分别报道了肿瘤患者CD4⁺CD25⁺细胞的增高在患者预后判断中的价值。我们长期的临床检测结果也证实了肿瘤患者CD4⁺CD25⁺与正常对照相比明显升高。在建立CD4⁺CD25⁺参考区间的基础上,我们将用CD127或Foxp3作为Treg的特异性标志物,建立一个本实验室的Treg 细胞参考区间。

CD28是T细胞活化所需要的第二信号的重要成员,T细胞表面的协同刺激分子CD28与抗原递呈细胞表面的B7(CD80、CD86) 分子相互作用产生T细胞活化的第二信号,促进T细胞内 IL-2基因转录合成和T细胞增殖,缺乏协同刺激信号可导致T细胞无能,T细胞活化和增殖水平下降直接导致抗感染(尤其是抗病毒感染)细胞免疫力的下降和组织相容性复合体限制的杀伤功能受损。本研究发现CD8⁺CD28⁺表型的T淋巴细胞百分含量随年龄增加而降低,提示T淋巴细胞激活的第二信号CD28的表达下降,可能与老年人免疫清除和免疫监视系统功能下降,受损、抗感染和抗肿瘤能力下降(从而导致肿瘤免疫逃逸)有关,是老年人对病原体易感和肿瘤高发病率的原因之一。

虽然T淋巴细胞亚群受性别、年龄的影响,但不同性别、年龄间差异在10%内(除非有特殊需要的试验需建立某个年龄段的参考区间),可以合并数据建立上海地区的T淋巴细胞亚群的参考区间。本研究的试验数据与国内外文献的数据相比百分比略有不同,但绝对值相差不多,说明的确存在地域、人种差异,通过对中位数、最小值、最大值的分析发现存在个体差异,所以检测T淋巴细胞亚群中CD3⁺ 、CD3⁺ CD4⁺ 、CD3⁺ CD8⁺、CD4⁺ /CD8⁺,不能单纯凭数值来判断其免疫状态,每个人都有其独特的T淋巴细胞亚群及比值,需动态观察个人T淋巴细胞亚群及比值的变化才能更好地判断疾病的发生和进展。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

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CD8+CD28- cells and CD4+CD25+ regulatory T cells in the peripheral blood of advanced stage lung cancer patients

1.GATA Haydarpa?a Training Hospital Department of Medical Oncology Istanbul Turkey 2.Kartal Lütfi K?rdar Hospital Department of Medical Oncology Istanbul Turkey 3.GATA Haydarpa?a Training Hospital Department of Hematology Istanbul Turkey

Aim To evaluate the CD8+CD28− and CD4+CD25+ regulatory T (Treg) cells in addition to other some lymphocyte subgroups in peripheral blood of advanced stage lung cancer patients. Methods The study group (n = 28) comprised chemotherapy and radiotherapy na?ve patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) and small cell lung cancer (SCLC). The control group (n = 22) consisted of age- and sex-matched healthy volunteers. Flow cytometry was used to count T cells, natural killer (NK) cells and CD4+CD25 Treg cells, and for CD8+ T cell subgroup analysis. Flow cytometry was performed and annexin V binding was used for apoptotic cell evaluation. Results In patient group, the percentage of CD8+CD28− cells among lymphocytes was elevated, and there was also an increase in the CD28−/CD28+ cell ratio among CD8 lymphocyte population. The distribution of CD8 cells was different in lung cancer patients when compared with the control group. The absolute count of CD4+CD25^bright cells and the percentages of these cells among total lymphocytes were higher in the patient group. The Annexin V(+) cell percentages among CD8+CD28− and CD8+CD28+ lymphocytes were higher in the patient group than in the control group. No differences were found between the NSCLC and SCLC patients with respect to the hematological parameters and the distribution of lymphocyte subgroups. In NSCLC patients, the percentage of CD8+CD28− cells among the lymphocyte population was higher in patients with stage IV than those with stage III. Conclusion These findings may reflect the possibility of tumor-induced immunosuppression and they should be complemented with further studies.

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26.199

0.0

... 组(19~29岁)中CD4⁺CD45RA⁺显著高于其他年龄组,可能的解释是初始T细胞CD45RA⁺在抗原刺激下发生增殖反应,其表面CD45RA表达下降,从具有免疫抑制作用的原始T淋巴细胞(未致敏T细胞)转化为具有辅助诱导作用的记忆T细胞^[14] ...

2006

13.214

0.0

... 随着研究的深入,发现Treg细胞最理想的表面标志是CD4⁺CD25⁺CD127^low或CD4⁺CD25⁺Foxp3^[15,16,17] ...

2010

3.409

0.0

... 随着研究的深入,发现Treg细胞最理想的表面标志是CD4⁺CD25⁺CD127^low或CD4⁺CD25⁺Foxp3^[15,16,17] ...

... 动物实验模型中发现CD4⁺CD25⁺细胞能增强自然杀伤细胞杀死肿瘤的能力^[16],Kayser等^[4]和Karag#cod#x000f6 ...

2007

0.0

. 2007, 56(5):641-648 DOI:10.1007/s00262-006-0225-8

Metronomic cyclophosphamide regimen selectively depletes CD4+CD25+ regulatory T cells and restores T and NK effector functions in end stage cancer patients

1.Unité INSERM 517, Faculté de Médecine 7 boulevard Jeanne D’Arc 21000 Dijon France 2.Centre de Lutte contre le Cancer Dijon France 3.Villejuif, Faculté de Médecine Kremlin Bicêtre ERM-0208 INSERM, Institut Gustave Roussy Paris France 4.Villejuif, Faculté de Médecine Kremlin Bicêtre Department of Medicine, Institut Gustave Roussy Paris France

... 随着研究的深入,发现Treg细胞最理想的表面标志是CD4⁺CD25⁺CD127^low或CD4⁺CD25⁺Foxp3^[15,16,17] ...