作者简介:倪语星,男,1953年生,博士,主任技师,主要从事临床微生物学和医院感染控制研究。
本期“微生物分子诊断专题”精心组织了6篇文章,包括1篇综述和5篇专著。内容主要围绕临床常见的细菌、真菌和分枝杆菌感染等的诊断、治疗(耐药)、预防和控制问题,重点介绍了分子生物学技术在临床微生物标本的直接检测、基因分型、耐药基因研究、抗原制备及血清学诊断等方面的应用研究。血流感染是一种严重的全身感染性疾病,但血培养存在检验周期长、阳性率低等问题,应用分子生物学技术能够对血流感染中的常见或少见病原菌、分枝杆菌、苛养菌等进行快速鉴定及耐药分析,可以缩短检验周期。艰难梭菌是一种重要的医院感染病原菌,引起抗菌药物相关性腹泻,GeneXpert实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)能够直接检测粪便标本中的艰难梭菌,具有快速、操作简便等优点。光滑念珠菌可引起血流感染等多种感染,且耐药性强,是医院感染中常见的侵袭性真菌,微卫星多态性分析法简便快速,分辨力高于多位点序列分析(MLST),可作为临床实验室光滑念珠菌基因分型方法。近年来白念珠菌对唑类抗真菌药的耐药性有增高趋势。“白念珠菌对唑类耐药的机制和生物膜相关基因的表达”一文提示
We carefully organized 6 manuscripts, including 1 review and 5 research papers for the molecular microbiology diagnosis special issue, mainly about the diagnosis, treatment(resistance), prevention and control of clinical common bacterium, fungus and mycobacterium infections. The special issue focuses on the application research of molecular biology techniques in the direct detection of clinical specimens, genotyping, resistance gene research, antigen preparation, serological diagnosis and so on. Blood stream infection is a serious infectious disease, but blood cultures have the problem with long turn-around-time and low positive rate. The application of molecular biology techniques can be used to the detection of common or rare pathogenic bacteria, mycobacteria, fastidous bacteria for rapid identification and drug resistance analysis in the blood stream infection, which can shorten the turn-around-time.
本期“微生物分子诊断专题”在各位专家和编纂人员的努力下,现在与读者见面了。本期精心组织了6篇文章,包括1篇综述和5篇专著。内容主要围绕临床常见的细菌、真菌和分枝杆菌感染等的诊断、治疗(耐药)、预防和控制问题,重点介绍了分子生物学技术在临床微生物标本的直接检测、基因分型、耐药基因研究、抗原制备及血清学诊断等方面的应用研究,希望对广大临床实验室、临床检验及医院感染控制方面的专家和学者有所帮助,也希望广大临床微生物检验工作者关注分子生物学技术在临床微生物检验领域的最新进展和应用前景。
该文综述了血流感染分子诊断的研究进展。目前,临床实验室用于血流感染检测的分子生物学技术主要包括核酸杂交技术、核酸扩增及DNA序列分析、基因芯片和质谱检测技术等。通过分析患者血液标本中病原微生物的核酸成分,能快速提供准确的细菌、真菌或病毒感染信息,甚至还能够分析常见病原菌的耐药基因。
血流感染是一种严重的全身感染性疾病,如果诊断延误导致治疗不当可危及患者生命。目前传统的血培养仍是诊断细菌性血流感染的金标准,但因为方法学的限制,血培养存在检验周期长、阳性率低等问题。联合应用分子生物学技术能够对血流感染中的常见或少见病原菌、分枝杆菌、苛养菌等进行快速鉴定及耐药分析,可以在较短时间内为临床提供可靠的诊断线索,帮助临床合理用药,改善血流感染患者的预后。
这是一项新技术临床应用的评估研究。用GeneXpert实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)直接检测临床患者粪便标本中艰难梭菌,并与常规厌氧培养结果进行比对。采用双拭子蘸取临床未成形粪便标本,一支用于GeneXpert实时荧光定量PCR检测艰难梭菌毒素基因 tcdB,另一支用于常规厌氧培养检测。对PCR检测结果与常规厌氧菌培养结果的一致性进行统计学分析,计算PCR的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值等参数。结果与常规厌氧菌培养结果相比,2种方法的一致性较好( Kappa=0 .775 0, P<0.01),GeneXpert实时荧光定量PCR的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为87.2%、92.2%、81.0%和94.9%。
艰难梭菌是一种重要的医院感染病原菌,引起抗菌药物相关性腹泻(伪膜性肠炎),常在医院内引起爆发流行,严重者可致死亡。经典的检测方法是厌氧培养加毒素测定,但需要一定的仪器、设备和技术,常规实验室难以开展。GeneXpert实时荧光定量PCR能够直接检测患者粪便标本中的艰难梭菌,具有检测快速、操作简便等优点,具有重要的临床应用价值。
本研究评估了微卫星多态性分析技术在光滑念珠菌临床分离株基因分型中的作用。 收集2011年1月至2012年12月上海仁济医院和东方医院临床分离的光滑念珠菌59株,分别采用多位点序列分析(multilocus sequence syping, MLST)和微卫星多态性分析技术进行基因分型,比较2种方法的结果和分辨力。结果显示59株光滑念珠菌经MLST分型得到6个序列型,其中ST-7型43株、ST-10型7株、ST-15和ST-55各3株、ST-3型2株、ST-43型1株,鉴别力指数(index of discriminatory power, DP)为0.456;经微卫星多态性分析可分为10型,其中A型25株、B型10株、C型8株、D型6株、E型3株、F型和G型各2株、H~J型各1株,DP为0.770。
光滑念珠菌可引起血流感染等多种感染,且耐药性强,是医院感染中常见的侵袭性真菌。医院感染控制常常需要进行基因分型和同源性分析。本文结果表明,微卫星多态性分析方法简便快速,分辨力高于MLST技术,可作为实验室基因分型的首选方法。
上海市公共卫生临床中心收集2006至2011年92例感染性疾病患者血液、无菌部位和黏膜分离鉴定的白念珠菌共104株,检测出16株至少对1种唑类药物耐药、6株至少对1种唑类药物剂量依赖性敏感的白念珠菌。药物靶酶基因 ERG11在白念珠菌耐药株、浓度依赖性敏感(susceptible dose dependent, S-DD)株和敏感株之间的差异有统计学意义( P=0.007 8),且耐药株、S-DD株分别与敏感株比较,差异有统计学意义( P<0 .05),而 CDR1、 CDR2和 MDR1表达量在3种菌株间差异无统计学意义( P>0 .05)。生物膜形成能力试验显示16株菌生物膜形成能力增强,其 HWP1表达量与 LBFs比较,差异有统计学意义( P=0 .007 9),而 ALS3表达量差异无统计学意义( P>0.05)。
白念珠菌是临床最常见的致病性真菌,治疗主要应用唑类抗真菌药。近年来白念珠菌对唑类抗真菌药的耐药性有增高趋势,引起临床高度重视。本文研究了白念珠菌临床分离株对唑类耐药和生物膜形成相关基因的表达。结果提示 ERG11基因的过度表达为白念珠菌对唑类耐药的重要机制。菌丝细胞壁蛋白 HWP1基因的高表达与白念珠菌生物膜形成增强相关。
本研究建立了敲除肺炎克雷伯菌耐药菌株质粒上碳青霉烯类耐药基因的方法。用PCR分别扩增试验菌株待敲除目的基因 bla KPC-2的上下游片段及质粒pMQ300的潮霉素耐药基因片段,采用重叠延伸基因扩增技术(gene splicing by ovorlap extension-PCR, SOE-PCR)构建融合片段,以耐阿普霉素的λ red质粒pKOBEG-Apr为介导,同源重组敲除临床肺炎克雷伯菌耐药菌株的 bla KPC-2。结果显示不同MLST型别的2株临床分离的肺炎克雷伯菌耐药菌株 bla KPC-2被成功敲除。
肺炎克雷伯菌致病性强,耐药性强,可引起多部位的感染,是临床感染重要的致病菌。近年来对碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌增多,引起临床的高度重视。国内外对碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的耐药机制主要是产生由质粒介导的KPC-2。本研究建立的λ red同源重组法能够可靠敲除肺炎克雷伯菌耐药菌株质粒上的 bla KPC-2,为进一步详细研究 bla KPC-2在耐药中所起的作用奠定基础。
本研究构建结核分枝杆菌融合基因2× esat-6原核表达载体,利用耻垢分枝杆菌诱导表达、纯化早期分泌抗原ESAT-6重组二聚体(recombinant dimer ESAT-6,rdESAT-6),用Western blot分析其抗原性,并评估其在结核病患者中的血清学诊断价值。收集126例确诊的结核病患者和42名健康体检者的血清,用间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和结核斑点金免疫渗滤试验(tuberculosis dot immunogold filtration assay, TB-DOT)检测血清结核抗体,评估rdESAT-6在结核血清学诊断中的价值。成功构建了pMF41-2× esat-6重组质粒,以包涵体形式表达了rdESAT-6蛋白,纯化的蛋白纯度在95%以上,可与小鼠抗rdESAT-6血清发生特异性反应。126例结核病患者血清检测结果表明,rdESAT-6蛋白在结核分枝杆菌阳性组和阴性组患者血清学诊断的敏感性分别为79.75% (63/79)、61.70% (29/47),好于TB-DOT检测方法。2种方法对42名健康体检者血清诊断特异性均为95.24% (40/42)。
目前结核病的诊断仍主要依靠传统的涂片和培养方法,涂片的敏感性低,而培养需要长达4~8周的时间。尚没有理想的结核病血清学检测方法,主要原因在于很难找到敏感性和特异性均很高的结核分枝杆菌抗原,并缺乏理想的抗原制备方法。本研究制备的结核分枝杆菌融合蛋白rdESAT-6用于结核病血清学检测具有较好的敏感性和特异性,可作为结核病血清学诊断的优选抗原。