1.现有试剂

试剂1(R1):100 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH值7.8),8 kU/L尿素酶,0.5 kU/L谷氨酸脱氢酶,1.5 mmol/L二磷酸腺苷,0.8 g/L叠氮钠;试剂2(R2):100 mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH值9.6),0.3 mmol/L还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,13.0 mmol/L α-酮戊二酸,0.8 g/L叠氮钠。

2.改良试剂

R1:100 mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH值9.1),0.3 mmol/L还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸;R2:100 mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH值7.6),40 kU/L尿素酶,2 kU/L谷氨酸脱氢酶,30 mmol/L α-酮戊二酸,0.8 g/L叠氮钠。

3.进口尿素试剂

进口和光尿素测定试剂(简称和光试剂)购自日本和光公司(批号TL953)。

4.校准品

改良试剂和现有试剂校准品均购自罗氏公司(批号169512-01)。和光试剂校准品为试剂盒自带。

5.仪器

日立7180全自动生化分析仪(日本日立公司)。

反应温度为37 ℃,比色杯光径为1.0 cm,检测主波长340 nm,副波长405 nm,样本(校准管以校准品做样本)加R1混匀,孵育3~5 min后加入R2混匀,孵育1.5 min后连续检测3 min吸光度( A)值变化。其中样本用量5 μL,R1用量200 μL,R2 用量50 μL,根据仪器使用说明及分析参数编制检测程序。现有试剂和改良试剂均采用罗氏校准品定标,和光试剂采用自带校准品定标。

有关试剂空白 A值及变化率、检测限、分析敏感性、精密度、线性范围、方法学比对和干扰试验等评价参照美国临床实验室标准化委员会EP系列文件及国内外惯用方法进行^{[ 2, 3, 4, 5]}。

1.空白 A值及变化率

在波长340 nm(光径1.0 cm)处检测,以蒸馏水为样本,重复测定2次。

2.检测限

以蒸馏水为样本,用试剂重复测定20次。

3.分析敏感性

用3种试剂分别测定尿素浓度为16.7 mmol/L的样本,记录在试剂规定参数下产生的 A值改变,换算为 A值变化率。

4.精密度

按NCCLS EP5-A2文件^{[ 2]}评价。取高值和低值的患者混合血清各1份,测定20次,评价批内精密度;取上述高、低值混合血清各自分装成20份,并于-20 ℃避光冰冻保存,每天取高、低值混合血清各1份,完全溶解后测定,计算批间精密度。

5.线性评价

按NCCLS EP6-A文件^{[ 3]}评价。取尿素高、低值血清样本各1份。将高值和低值血清分别按不同比例混合稀释成不同浓度梯度的样本,并将这些样本随机排列进行测定,各个浓度重复测定5次,取其均值为测定值,与预期值做线性对比。

6.方法学比对试验

按NCCLS EP9-A2文件^{[ 4, 5]}评价。每天收集检测范围均匀分布的8份患者新鲜血清,连续5 d,共40份样本。每份样本都用5种试剂各自进行双份测定,测定顺序依1→8测定第1次,再按反序8→1测定第2次,以减少交叉污染及漂移对重复测定标本平均值的影响,顺序中的浓度应尽可能随机排列。同一样本均在2 h内完成两法的测定。

7.干扰试验

按照NCCLS EP7-A文件^{[ 6]}评价。分别测定加入干扰物的高、低值混合血清。

8.参考区间

按照NCCLS C28-A2文件^{[ 7]}评价。采集240名健康参考个体血清样本进行检测。对正态分布的数据资料其参考区间由95%可信区间表示;对偏态分布的数据资料采用百分位数法表示。

所有数据用Excel 2007软件进行统计处理、作图分析及偏差评估计算。

现有试剂空白 A值为1.8,空白 A值变化率为-0.001 8;改良试剂空白 A值为1.8,空白 A值变化率为-0.001 9;和光试剂空白 A值为1.6,空白 A值变化率为-0.000 4。

现有试剂检测限为0.035 mmol/L,改良试剂检测限为0.014 mmol/L,和光试剂检测限为0.075 mmol/L。

现有试剂的分析敏感性为-0.04,改良试剂为-0.13,和光试剂为-0.05。

改良试剂测定高、低值血清的批内精密度分别为0.45%和0.85%,批间精密度分别为0.38%和0.71%。

相关方程为 Y=0 .921 6 X+0 .595, R²=0.998 6。线性浓度范围为0~38 mmol/L。见图1:

图1

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	图1 改良试剂线性评价

注: Y= 0 .921 6 X + 0 .595; R² = 0.998 6

1.检查离群点

通过计算可知试验评估系统(改良试剂)及参比系统(和光试剂)均无方法内和方法间离群点。

2.散点图、偏倚图分析

以和光试剂检测的测定结果为 X,改良试剂的检测结果为 Y,经组内、组间离群值检验后,画散点图和偏倚图。由散点图可知改良试剂与和光试剂之间的线性关系良好,见图2、图3:

图2

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	图2 尿素重复测定均值的散点图

注: Y= 0 .927 7 X + 0 .411 5; R² = 0.999 1

图3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 尿素各次测定结果的散点图

注: Y= 0 .927 7 X + 0 .411 5; R² = 0.999

由偏倚图可知改良试剂与和光试剂测定同一份血清时差值较小,分布较为合理,见图4、图5:

图4

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	图4 尿素重复测定均值偏差图

图5

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图5 尿素各次测定结果偏差图

3. X值合适范围的检验及线性回归分析

对尿素测定结果进行相关回归分析, r=0.999>0.975,说明测定范围足够宽,误差的影响可以忽略不计。回归方程为 Y=0 .93 X+0.41。

4.偏差估计

根据NCCLS EP9-A2文件提供的公式^{[ 4]},并选择尿素的2个医学决定水平14.2和28.0 mmol/L,对预期偏倚及可信区间进行计算,判断2种试剂是否相当。以美国临床实验室改进修正法规(CLIA'88)的允许误差(9%)为限,计算得其允许偏倚分别为1.28和2.52 mmol/L。2个医学决定水平的预期偏差95%可信区间上限均低于各自的允许偏倚,见表1:

表1

表1

表1 预期偏倚及可信区间的比较 医学决定水平 (mmol/L) 允许偏倚 (mmol/L) 预期偏差95%可信区间 (mmol/L) 偏倚 评估 下限 上限 14.2 1.28 -0.69 -0.54 可接受 28.0 2.52 -1.74 -1.48 可接受

表1 预期偏倚及可信区间的比较

说明改良试剂与和光试剂的偏倚可接受,试剂间检测结果具有良好的可比性。

以相对偏差≥10%作为有明显干扰的评判指标。342 μmol/L结合胆红素、342 μmol/L非结合胆红素、0.03 g/L维生素C、5 g/L血红蛋白浓度、1 450 FTU乳糜对高、低值血清样本检测结果均无干扰。

测定240名健康人(男120名、女120名)空腹血清尿素浓度,测定数据经分析呈正态分布,总检测参考区间为1.4~7.2 mmol/L。