引用本文
井发红, 慕玉东, 徐纪茹, 康炜. 宫颈癌与HPV16E6及hWAPL的相关性研究. 检验医学2014, 29(4): 303-306[JING Fahong, MU Yudong, XU Jiru, KANG Wei. Correlation research of HPV16E6 and hWAPL with cervical cancer. Labratory Medicine, 2014, 29(4): 303-306]  
Permissions
Copyright©2014, 《检验医学》编辑部
《检验医学》编辑部版权所有
宫颈癌与HPV16E6及hWAPL的相关性研究
井发红1, 慕玉东2, 徐纪茹1, 康炜3
1.西安交通大学医学院,陕西 西安 710061
2.陕西省肿瘤医院, 陕西 西安 710061
3.西安医学院附属医院,陕西 西安 710077

作者简介:井发红,女,1980年生,硕士,主管技师,主要从事临床微生物学检验工作。

通讯作者:徐纪茹,联系电话:029-82657814。

摘要
目的

检测宫颈不同级别病变组织中人乳头瘤病毒16E6(HPV16E6)及人半翼基因(hWAPL)的表达,分析宫颈癌与HPV16E6及hWAPL蛋白的相关性,为早期诊断宫颈癌提供依据。

方法

采用免疫组化方法检测宫颈不同级别病变组织的石蜡包埋块,其中宫颈上皮细胞内瘤变(CIN)Ⅰ或CIN Ⅱ 49例,CIN Ⅲ或原位癌33例,宫颈浸润癌(ICC)28例,正常宫颈上皮组织16例。

结果

HPV16E6与hWAPL在正常宫颈组、CIN Ⅰ或Ⅱ组、CIN Ⅲ组和ICC组的组织中阳性表达率呈逐渐增高趋势,HPV16E6与hWAPL在CIN Ⅲ组和ICC组的阳性表达率与正常宫颈组、CIN Ⅰ或Ⅱ组差异有统计学意义(P<0.05)。CIN Ⅲ组和ICC组HPV16E6蛋白阳性表达率差异有统计学意义(P<0.05),而hWAPL蛋白的阳性表达率无明显差异(P=0.372)。HPV16E6与hWAPL的表达强度在ICC组、CINⅢ组明显高于CINⅠ或Ⅱ组和正常宫颈组(P<0.05),而ICC组与CINⅢ组之间无明显差异(P>0.05)。64例HPV16E6阳性者中57例(89.06%)hWAPL蛋白表达阳性,62例阴性者中15例(24.19%)hWAPL蛋白表达阳性。经统计学处理,二者有明显相关性(P<0.05),而且HPV16E6感染强度与hWAPL表达呈正相关(r=0.595,P<0.001)。

结论

hWAPL基因是宫颈癌特异性高表达基因,具有癌基因特性,可能是宫颈癌发生机制中的重要环节,而且可能成为新的检测指标,用于宫颈鳞癌的基因诊断、治疗及明确病变程度。

关键词: 人乳头瘤病毒16E6; 人半翼基因; 宫颈癌; 免疫组化
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2014)04-0303-04
Correlation research of HPV16E6 and hWAPL with cervical cancer
JING Fahong1, MU Yudong2, XU Jiru1, KANG Wei3
1.Xi'an Jiaotong University School of Medicine, Shanxi Xi'an 710061, China
2.The Tumor Hospital of Shanxi Province, Shanxi Xi'an 710061, China
3.The Affiliated Hospital of Xi'an Medical College, Shanxi Xi'an 710077, China
Abstract
Objective

To investigate the expressions of human papillomavirus 16E6 (HPV16 E6) and human wings apart-like gene (hWAPL) in different levels of cervical lesions and the relationship of HPV16E6 and hWAPL protein with cervical cancer, and to provide the reference for the early diagnosis of cervical cancer.

Methods

By immunohistochemistry, the paraffin-embedded blocks with different levels of cervical lesions were detected, including 49 patients with cervical intraepitelial neoplasia (CIN) Ⅰ or CIN Ⅱ, 33 patients with CIN Ⅲ or carcinoma in situ, 28 patients with invasive cervical carcinoma (ICC) and 16 patients with normal cervical epithelium.

Results

In normal, CIN Ⅰ or Ⅱ, CIN Ⅲ and ICC groups, the positive expression rates of HPV16E6 and hWAPL showed gradually increasing trend. The positive expression rates of HPV16E6 and hWAPL in CIN Ⅲ and ICC groups had statistical significance with those in normal and CIN Ⅰ or CIN Ⅱ groups (P<0.05). Between CIN Ⅲ and ICC groups, the positive expression rate of HPV16E6 had statistical significance (P<0.05), but the positive expression rate of hWAPL protein had no obvious difference (P=0.372). HPV16E6 and hWAPL expression strengthes in ICC group and CIN Ⅲ group were obviously higher than those in CIN Ⅰ or Ⅱ group and normal group (P<0.05), and there was no obvious difference between ICC and CIN Ⅲ groups (P>0.05). The 57 of 64 patients (89.06%) with HPV16E6 had the positive expression of hWAPL protein, 15 of 62 patients (24.19%) with no HPV16E6 had the positive expression of hWAPL protein. By statistical analysis, both HPV16E6 and hWAPL protein had significant correlation (P<0.05), and it showed that the infection intensity of HPV16E6 and the expression of hWAPL had positive correlation (r=0.595,P<0.001).

Conclusions

ThehWAPL may be a cervical cancer-specific gene and expresses highly, and it may be important in the pathogenesis of cervical cancer. ThehWAPL may become the new target gene for the diagnosis, treatment and lesion identification of cervical cancer.

Keyword: Human papillomavirus 16 E6; Human wings apart-like gene; Cervical cancer; Immunohistochemistry
引言

目前研究已经证实人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)是宫颈癌的主要致病因子,持续性的HPV感染导致了宫颈癌前病变的发生和发展,90%以上的宫颈癌组织合并HPV感染,携带高危HPV DNA。迄今,已经发现120 余种HPV基因型,其中约20种与肿瘤有关。根据HPV与宫颈癌的关系将HPV分为低危型和高危型,其中HPV16、18、31、33、35、45 等属高危型,与高级别宫颈上皮细胞内瘤变(cervical intraepitelial neoplasia, CIN)和宫颈癌相关。宫颈癌中最常见的HPV 类型是HPV16、18,其中 HPV16 型占60%以上。

有研究发现人半翼基因(human wings apart- like, hWAPL)是一个宫颈癌特异性高表达基因,是果蝇体内 WAPL基因在人体内的同源序列,主要功能是管理异染色质结构,维持姐妹染色单体的黏合。本实验研究宫颈不同级别病变组织中HPV16E6 、hWAPL蛋白质的表达,分析宫颈癌与HPV16E6及hWAPL表达水平的相关性。

材料和方法
一、临床资料

收集2010年1至6月在陕西省肿瘤医院住院手术切除宫颈组织的石蜡包埋块126例。其中CIN Ⅰ或Ⅱ 49例,CIN Ⅲ或原位癌33例,宫颈浸润癌(invasive cervical carcinoma, ICC)28例,正常宫颈上皮组织16例。宫颈癌的临床分期采用国际妇产科联盟2000年修订的临床分期标准[ 1]。所有病例均经病理诊断证实,所有患者均未接受过放疗、化疗等治疗措施。患者年龄25~66岁,平均年龄42.6岁。

二、检测方法

本实验采用免疫组化方法检测宫颈不同级别病变组织的石蜡包埋块;hWAPL兔抗人多克隆抗体购自美国ABCAM公司;免疫组化SP-0023试剂盒购自北京博奥森生物技术公司;鼠抗人HPV16E6单克隆抗体为北京中山生物技术有限公司产品。

三、结果判定

本实验采用显色强度结合阳性细胞百分比法判读结果。以细胞内出现浅黄色、棕黄色颗粒为阳性。在高倍镜下(400×)对每张切片随机选择5个视野,每个视野计数200个肿瘤细胞,共计1 000个。阳性细胞数<5%为阴性(-),5%~10%为(+),11%~50%为(++),>50%为(+++)。(+)~(+++)均被判为阳性。

四、统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理,计数资料采用 χ2检验,等级资料用秩和检验、相关用Spearman相关分析,检验水准 a=0.05。

结果

一、HPV16E6与hWAPL在不同宫颈组织中表达阳性率(见表1)

HPV16E6在正常宫颈组、CIN Ⅰ或Ⅱ组、Ⅲ组和ICC组的组织中阳性表达率分别为18.75%、28.57%、69.70%和85.71%,hWAPL在正常宫颈组、CINⅠ或Ⅱ组、CIN Ⅲ组和ICC组的组织中阳性表达率分别为6.67%、36.73%、81.28%和92.86%,呈逐渐增高趋势。HPV16E6与hWAPL在CIN Ⅲ组和ICC组的阳性表达率与正常宫颈组、CIN Ⅰ或Ⅱ组差异有统计学意义( P<0.05)。CIN Ⅲ组和ICC组HPV16E6蛋白阳性表达率差异有统计学意义( P<0.05),而hWAPL蛋白的阳性表达率差异无统计学意义( P=0.372)。见表1:

表1 HPV16E6与hWAPL在不同宫颈组织中的表达阳性率
图1~3为HPV16E6蛋白表达的免疫组化结果:

图1 HPV16E6(阴性) (×100)图2 CINⅢHPV16E6(阳性) (×200)图3 ICC HPV16E6(阳性) (×200)

图4~6为hWAPL蛋白表达的免疫组化结果:

图4 hWAPL (阴性) (×200)图5 CINⅡ hWAPL (阳性) (×200)图6 ICC hWAPL (阳性) (×400)

二、HPV16E6与hWAPL在不同宫颈组织中表达的阳性强度

HPV16E6与hWAPL的表达强度在ICC组、CINⅢ组明显高于CINⅠ或Ⅱ组和正常宫颈组( P<0.05),而ICC组与CINⅢ组之间无明显差异( P>0.05)。见表2:

表2 HPV16E6与hWAPL在不同宫颈组织中的阳性强度
三、HPV16E6 和 hWAPL蛋白在不同宫颈组织中表达的相关性

64例HPV16E6阳性者中57例(89.06%)hWAPL蛋白表达阳性,62例阴性者中15例(24.19%)hWAPL蛋白表达阳性。经统计学处理,二者有明显相关性( P<0.05)。进一步用Spearmen相关性分析显示, hWAPL基因表达与HPV16E6感染强度呈正相关( r=0.595, P<0.001)。见表3:

表3 HPV16E6和hWAPL在不同宫颈组织中表达的相关性
讨论

宫颈癌是一个多阶段多步骤的发展过程,从正常上皮细胞到ICC的过程中,很多基因参与了发生过程。国外学者提出HPV可能是最终导致生殖道肿瘤的性传播致病因子[ 2],已经明确90%以上的宫颈癌患者有HPV持续感染的病史,是引起宫颈癌及CIN的主要病因,正如Walboomers等[ 3]认为:几乎所有宫颈癌患者的病理样本中均能找到HPV。90%以上的宫颈癌组织合并HPV感染或携带高危型 HPV DNA。

近20年来,大量研究发现HPV有120余种基因型,其中约35种亚型可以感染生殖道,约20种与肿瘤有关。HPV感染具有明显的区域性、民族差异性,且感染率差异很大的特点。从国内外的研究报道显示,虽然HPV亚型的分布具有显著的地域性,但HPV16型感染比较多见,国际癌症研究协会对已发表的85份研究中的10 058例宫颈癌病例进行分析,发现HPV16型感染率为51.0%[ 4],与国内大多数研究一致,在宫颈癌患者中HPV16型感染为主。我们采用免疫组化的方法对样本进行检测,发现HPV16E6蛋白在CIN及宫颈鳞癌组织中高表达,而且呈逐渐增高趋势,进而证实了高危型HPV16与宫颈癌密切相关。

新近研究发现与宫颈癌关系十分密切的一个基因,即 hWAPL[ 5, 6]。 WAPL基因编码的蛋白质主要功能是管理异染色质结构,维持姐妹染色单体的黏合。 WAPL基因的变异会妨碍姐妹染色单体的正常靠近和并列,但不影响染色单体各自的凝集和分离[ 7, 8]。 WAPL基因其编码的一种聚合锚定蛋白,可以在有丝分裂前期使染色体臂的聚合适时解离。但其过度表达则会使得姐妹染色单体过早解离[ 9]。因此,国外研究人员初步推测 hWAPL基因可能是一种宫颈癌特异性高表达基因,推动了宫颈癌基因治疗的研究进展。目前关于hWAPL蛋白表达在我国妇女宫颈癌组织中的表达情况报道甚少,本实验采用免疫组化技术对不同级别的组织研究,发现hWAPL蛋白表达强度随病变加重而增强,与国外的研究相一致[ 10],支持 hWAPL基因可能是宫颈癌特异性基因,为临床宫颈癌基因治疗的研究提供了理论依据。

综上所述,本实验的初步研究结果表明HPV16E6和hWAPL蛋白质表达在宫颈癌组织呈现高表达,而且两者与宫颈癌密切相关,显示两者之间也有明显的相关性。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 乐杰. 妇产科学[M]. 第6版. 北京: 人民卫生出版社, 2004: 291. [本文引用:1] [CJCR: 0.467]
[2] Zur Hausen H. Papillomaviruses in human cancer[J]. Cancer, 1987, 59(10): 1692-1696. [本文引用:1] [JCR: 5.201]
[3] Walboomers JM, Jacobs MV, Manos MM, et al. Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide[J]. J Pathol, 1999, 189(1): 12-19. [本文引用:1] [JCR: 7.585]
[4] Franceschi S. The IARC commitment to cancer prevention: the example of papillomavirus and cervical cancer[J]. Recent Results Cancer Res, 2005, 166: 277-297. [本文引用:1]
[5] Kuroda M, Oikawa K, Yoshida K, et al. Effects of 3-methylcholanthrene on the transcriptional activity and mRNA accumulation of the oncogene hWAPL[J]. Cancer Lett, 2005, 221(1): 21-28. [本文引用:1] [JCR: 4.258]
[6] Oikawa K, Ohbayashi T, Kiyono T, et al. Expression of a novel human gene, human wings apart-like (hWAPL), is associated with cervical carcinogenesis an tumor progression[J]. Cancer Res, 2004, 64(10): 3545-3549. [本文引用:1] [JCR: 8.65]
[7] Vernì F, Gand hi R, Goldberg ML, et al. Genetic and molecular analysis of wings apart-like (wapl), a gene controlling heterochromatin organization in drosophila melanogaster[J]. Genetics, 2000, 154(4), 1693-1710. [本文引用:1] [JCR: 4.389]
[8] Dobie KW, Kennedy CD, Velasco VM, et al. Identification of chromosome inheritance modifiers in Drosophila melanogaster[J]. Genetics, 2001, 157(4): 1623-1637. [本文引用:1] [JCR: 4.389]
[9] Gand hi R, Gillespie PJ, Hirano T, et al. Human Wapl is a cohesin-binding protein that promotes sister-chromatid resolution in mitotic prophase[J]. Curr Biol, 2009, 16(24): 2406-2417. [本文引用:1] [JCR: 9.494]
[10] 曹利仙, 潘巍巍, 黄玉蓉, 等. hWAPL基因shRNA真核表达载体的构建及干扰效果的初步鉴定[J]. 解剖学杂志, 2010, 33(4): 446-450. [本文引用:1]