血培养结果阳性是诊断脓毒症的“金标准”,通过对血液中的细菌进行分离培养、染色镜检及鉴定能够准确地确定细菌的种类;体外药物敏感性试验更为临床抗菌药物的合理使用提供了可靠的依据,这些都是其他方法所不能替代的。但是血培养也存在许多不足:阳性率低、耗时长、特殊致病菌很难通过普通培养检出,临床诊断困难^{[ 4]}。

对脓毒症患者外周血细胞分析可以动态反应患者感染状态,具有操作简单、检测速度快等优点。目前临床认为白细胞(white blood cell,WBC)<5×10⁹/L或≤3 d者WBC>25×10⁹/L,>3 d者WBC>20×10⁹/L应高度怀疑感染^{[ 5]}。然而有研究表明50%的新生儿脓毒症患儿WBC可在正常范围内,而且异常的WBC计数在其他病理条件下也可出现,因此WBC计数对于脓毒症诊断缺乏敏感性和特异性。

CRP是急性时相反应蛋白家族中的一种,健康人血清中浓度很低。当炎症、组织损伤和手术后其浓度显著增高,急性期浓度可升高上千倍,在炎症进程开始后6~12 h就可检测到^{[ 6]}。动态分析CRP的测定结果要比单一测定CRP结果更具诊断价值,当CRP测定结果接近80 mg/L时,炎症感染的诊断敏感性从67.6%增至93.4%,特异性从61.3%增至86.3%,结合体温>38.2 ℃,诊断特异性接近100.0%。CRP增高多见于细菌感染,而病毒感染检测结果常在参考范围以内,故可作为细菌感染与病毒感染的鉴别指标^{[ 7]}。

IL和TNF等细胞因子是全身感染的重要炎症介质,血中TNF-α、IL-6的水平与MODS的发生和严重程度有着很好的相关性,动态监测这些细胞因子对脓毒症的发生、发展有积极意义^{[ 8]}。IL-6在感染后1 h内释放,脓毒症症状出现前2 d明显升高,可以作为脓毒症的早期诊断指标。

5.PCT

PCT是降钙素的前体,其与急性时相蛋白类似,正常情况下血清中PCT水平极低(<0.1 ng/mL),机体细菌感染4 h时开始迅速升高,8~24 h达到顶峰,测定值在1~1 000 ng/mL之间,其在体内半衰期长,可达30 h,稳定性非常好,升高的程度反映了系统炎症反应的严重程度,对于临床检测有利。经抗菌药物或手术清除感染后,PCT水平显著下降,其特异性和敏感性明显优于CRP、WBC计数等^{[ 9]}。PCT>0.25 ng/mL即提示炎症感染,与器官衰竭和病死率相关,被认为是目前最好的脓毒症实验室诊断标志物^{[ 10]}。但是PCT在正常婴儿出生后48 h内均可观察到升高,诊断价值存在争议,且PCT在脓毒症与全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)的鉴别诊断和预后方面也存在不足,实验室检测成本较CRP、WBC计数等指标高,分析检测多以半自动仪器为主,效率低,临床应用价值并不十分理想。

细胞表面黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1 ,ICAM-1)主要存在于血管内皮细胞、成纤维细胞和部分上皮细胞中,介导WBC黏附于内皮细胞^{[ 11]}。sICAM-1主要来源于细胞表面的黏附分子脱落,其在血清中是与ICAM-1同型的蛋白质分子,是免疫球蛋白超家族黏附分子的成员之一,参与细胞间的识别、黏附和信号传递,介导WBC向炎症区移行和定位,脓毒症时是中性粒细胞和内皮细胞作用的关键,感染时细胞毒素、细胞因子均可上调sICAM-1的表达,在炎症早期对WBC活性的调节尤其重要^{[ 12]}。外周血WBC在静止状态下仅少量表达sICAM-1,脓毒症时sICAM-1明显升高,内毒素等致病因子可损害生物膜,激活免疫细胞产生多种细胞因子,如IL-1、TNF-α、γ干扰素(interferon gamma ,INF-γ),从而刺激内皮细胞,使黏附分子由胞内贮存池转移到细胞表面,或启动胞内mRNA的表达促使蛋白质合成增加,增强细胞间黏附作用,介导炎症反应^{[ 13]}。sICAM-1在脓毒症时具有敏感性高、升高速度快、持续时间长等优点,结合临床症状和感染因素,可为脓毒症早期诊断提供依据,但尚不能评价疗效。脓毒症休克时sICAM-1可明显升高,且与休克严重程度和器官衰竭程度相关,当sICAM-1>1 200 ng/mL时则提示患者死亡的可能性很高。

尿激酶型纤溶酶原激活物受体(urokinase plasminogen activator receptor,uPAR)是纤溶系统家族的重要成员,在血管内皮细胞、平滑肌细胞以及大多数WBC表面表达。当病理状态如肿瘤、炎症时,细胞表面的uPAR表达升高,从细胞表面脱落释放入外周血中形成suPAR。近来,suPAR被认为是诊断高危患者的潜在标志物。在健康个体suPAR水平含量低而稳定,为1.04~4.01 ng/mL,在SIRS、脓毒症和感染性休克时,外周血suPAR含量升高,且检测值水平与患者生存率相关^{[ 14, 15]}。Savva等^{[ 16]}研究发现,脓毒症的严重程度与血浆suPAR浓度呈正相关,当suPAR值达到10.5 ng/mL时,区分重度脓毒症和轻型脓毒症的特异性和阳性预测值分别为80.0%和77.6%,且该阳性预测值高于PCT(72.1%)、急性生理和慢性健康评分(acute physiology and chronic health evaluation ,APACHE Ⅱ)(73.3%),血浆suPAR在区分不同程度的脓毒症时工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线下面积(area under curve,AUC)为0.758,同样高于PCT(0.652)。

suPAR在脓毒症的早期诊断、疗效和预后评估中发挥重要作用,是一种反映感染性疾病严重程度及其预后的标志物,可以用于感染性疾病患者的危险度分级,从而有利于尽早制定出个体化治疗方案。然而,suPAR作为单一指标辅助诊断脓毒症的准确性较差,suPAR是否参与危重病发生和发展还需进一步探讨。

(1)血浆循环DNA (cell free DNA,cf-DNA)检测:目前以核酸为基础的实验诊断技术已应用于临床,利用分支链DNA Alu 技术定量检测脓毒症患者血浆中cf-DNA的表达水平,对脓毒症的诊断和鉴别诊断有较高的临床应用价值。cf-DNA是存在于人血液和体液中的细胞外DNA,正常人体内含量很少,但在炎症、肿瘤和免疫性疾病中表达升高^{[ 17]}。侯彦强等^{[ 18]}利用分支链DNA Alu 技术定量检测重症监护室内24例脓毒症患者、43例SIRS患者和73名健康人血浆cf-DNA的表达水平,结果显示脓毒症患者血浆cf-DNA水平明显高于SIRS患者和健康人群( P<0.001);ROC曲线分析发现,血浆cf-DNA指标对脓毒症具有较高的诊断价值(AUC=0.955),当最佳临界值为385 ng/mL时,敏感性为91.7%,特异性为98.6%。在脓毒症和SIRS的鉴别诊断中,血浆cf-DNA指标也表现出较高的价值,AUC为0.777,最佳临界值为522 ng/mL,敏感性为91.7%,特异性为60.5%^{[ 19]}。实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction ,PCR)是目前最常用的cf-DNA检测方法,但是该方法存在操作复杂、技术要求高等缺陷,不确定因素也较多;(2)细菌DNA检测:通过对细菌DNA或RNA进行扩增来检测细菌的存在,已成为微生物诊断的一个发展趋势。细菌主要包含16S、5S和23S 3个DNA序列,其中16S DNA序列保守性最强,序列中的某些片段为所有细菌共有。Loens 等^{[ 20]}通过设计细菌16S DNA基因保守区引物对临床标本进行PCR扩增,同时设置了标准菌株和人基因组作为阳性对照和阴性对照,结果发现所有标准菌株均出现了371 bp的阳性条带,而人基因组DNA无阳性条带出现,充分证明了此方法对细菌检测具有高度的特异性。PCR是一种扩增反应,此方法的最小检出量可达1 pg/mL,敏感性可达100.0%,特异性为96.8%。应用16S DNA保守区引物对细菌DNA进行扩增,其优点是不受抗菌药物影响,且不需要体外培养,节省了诊断时间,从而为脓毒症的早期诊断提供了强有力的支撑。

miRNAs是一类高度保守的非编码小RNAs, 大约包含21~22个核苷酸,其在肿瘤、炎症等病理状态特异性表达,并在细胞的发育、分化、增殖和凋亡等生物学过程中发挥作用。有研究发现,血清或血浆中存在多种miRNAs标志物,他们在疾病的诊断、治疗和预后过程中发挥作用,循环miRNAs最早在肿瘤领域备受关注。血浆miRNAs可作为脓毒症的诊断标志物,并有望成为脓毒症治疗新靶点。

脓毒症是由病原微生物感染引起的全身炎症反应,miRNAs可通过转录后水平下调炎症因子和炎症因子信号通路的受体来调控失衡的炎症反应,包括抗原呈递、TLR信号途径、细胞因子和淋巴细胞受体信号等。有研究发现,miRNAs可在脓毒症患者组表达水平明显低于SIRS组和健康组。其中,miRNA-146a在血浆的水平与IL-6类似,其在SIRS、脓毒症和健康者之间存在差异,可用于脓毒症与SIRS的鉴别。而血浆miRNA-233仅在脓毒症时降低,SIRS中不降低,其ROC曲线具有最高的AUC (0.858),miRNA-146a和IL-6的AUC仅次其后,分别为0.804和0.785,miRNA-233具备高的准确性和敏感性,有望成为脓毒症理想的诊断标志物^{[ 21]}。

综上所述,脓毒症是SIRS的一种,早期诊断并给予规范化治疗是降低死亡率的关键。虽然与脓毒症相关的标志物多达178种,但缺少理想的诊断标志物。目前诊断脓毒症仍以血培养为主,外周血WBC计数和分类、CRP和PCT等测定为辅。由于单一标志物诊断存在局限性,学者们开始转向多指标联合诊断技术的研究,旨在提高脓毒症的诊断准确性和临床实用性。相信随着科学技术的不断发展,研究人员的不懈努力,在不久的将来,人类一定会攻克这一难题,理想的脓毒症实验诊断标志物或实验诊断方法一定会出现。