选取湖州市中心医院2012年7月至2013年6月血液科初次就诊未治疗的ITP患者50例,其中男19例,女31例,年龄22~66岁。患者均按诊断标准^[3](均符合以下条件:多次实验室检查血小板计数减少;脾脏不增大或仅轻度增大;骨髓检查巨核细胞数量增多或正常,有成熟障碍;泼尼松治疗有效;排除继发性血小板减少症)确诊为ITP。20例对照者为湖州市中心医院内科住院发热待查的患者,经骨髓穿刺涂片检查(排除血液病)属正常骨髓象,均无出血性疾病和内分泌系统疾病,其中男9例,女11例,年龄19~59岁。

FACS Calibur流式细胞仪由美国BD公司提供。Gt F(ab')2 Anti-Human IgG-FITC、 Gt F(ab')2 Anti-Human IgM- FITC、Gt F(ab')2 Anti-Human IgA- FITC、CD41-PE及同型对照Goat F(ab')2 IgG- FITC均由美国Beckman-Coulter公司提供。

1.标本采集 所有对象在行骨髓穿刺涂片时抽取骨髓液1.5 mL,用乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na₂)抗凝处理,同时采集外周血1.0 mL。

2.血小板的富集 将抗凝的新鲜骨髓液1.5 mL及抗凝血1.0 mL 400× g离心15 min,分离富血小板血浆(RPR),取RPR 50200 μL(根据血小板多少取适量,调整细胞浓度为5×10⁶个细胞数/mL)各置于塑料管A中,各加入2 mL 磷酸盐缓冲液(PBS) 1 400× g离心15 min,去上清液后,加400 μL鞘液定容。在塑料管A中加入40 μL CD41-PE,充分混匀。另取4支试管,分别加入上述4种单抗试剂10 μL,再在各试管中加入塑料管A中的血小板悬液100 μL,室温暗处放置孵育15 min。再加入PBS 2 mL,1 400× g离心5 min洗涤1次,去上清后加1.0 mL鞘液定容。

3.流式分析 根据CD41/SSC设置血小板门,以同型对照管调整电压及荧光补偿,然后分别检测骨髓液及血液标本PAIgG、PAIgM、PAIgA荧光百分率和平均荧光强度(MFI)。

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,计量数据以 ±s表示,两均数间比较若方差齐性则采用方差分析和配对 t检验。 P<0.05表示差异有统计学意义。

ITP组骨髓及血液PAIgG水平差异有统计学意义( P<0.01),PAIgM及PAIgA水平2种标本间差异无统计学意义( P>0.05)。见表1:

表1

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表1 对照组与ITP患者骨髓、血液标本血小板相关抗体结果比较(%) 组别 例数 骨髓 血液 PAIgG PAIgM PAIgA PAIgG PAIgM PAIgA ITP组 50 30.46±14.20*▲ 15.36±6.25* 8.28±5.50* 15.30±8.01* 12.30±4.06* 7.89±4.33* 正常组 20 4.37±1.23 5.04±1.33 1.38±0.40 3.21±1.01 4.88±1.30 1.40±0.38 注:与对照组比较,* P<0.01;与血液标本比较,▲ P<0.01

表1 对照组与ITP患者骨髓、血液标本血小板相关抗体结果比较(%)

ITP患者骨髓标本PAIgG、PAIgM、PAIgA阳性率分别为98%、42%、46%,总阳性率为100%;均高于血液标本(76%、38%、44%,总阳性率为82%)。显示骨髓标本血小板相关抗体的敏感性更高。

表2

表2

表2 ITP患者2种标本血小板相关抗体阳性率比较 阳性率 (%) 骨髓 血液 PAIgG PAIgM PAIgA PAIgG PAIgM PAIgA 阳性率 98 42 46 76 38 44 阴性率 2 58 54 24 62 56

表2 ITP患者2种标本血小板相关抗体阳性率比较

目前ITP的发病机制尚未完全阐明,患者血小板相关抗体的增高与血小板数及血小板寿命呈负相关^[4]。PAIg是诊断ITP的1项敏感指标。本研究显示血液有82%的ITP患者血小板相关抗体阳性,骨髓为100%阳性。本研究血液数据略低于文献报道^[5],而骨髓阳性率明显高于血液标本。

本研究中骨髓PAIgG的浓度及阳性率均明显高于血液标本相关指标,可能是由于骨髓淋巴细胞产生的血小板特异的IgG自身抗体^[6]一方面优先与血小板结合,同时骨髓内结合了血小板抗体的血小板未被破坏,所以骨髓PAIgG水平及阳性率升高。从骨髓释放入血液的结合有血小板相关抗体的血小板在循环中进入脾脏或其它单核巨噬系统后被识别破坏,导致血液中PAIgG水平降低。PAIgM为5价的多聚体,是机体受抗原刺激后最早产生的抗体。PAIgM可激活补体,较IgG类高1 000倍左右,是具有最强活力的凝集抗体,其与血小板结合直接破坏大量血小板。PAIgA可以结合抗原,但不能激活补体的经典途径。因此,不能像PAIgG那样发挥生物效应。骨髓PAIgM、 PAIgA水平及阳性率与血液相当或偏高也验证了此理论。

综上所述,检测骨髓PAIg可以提高ITP患者的辅助诊断率,具有一定的临床价值。