实验所用血清样品取自2011年间兰州大学第一医院心脏中心住院的被确诊为冠心病的患者。将新鲜采集到的血清样品在-80 ℃下制成冻干粉备用。

1. 仪器

Agilent 6890/5973N GC/MS,配有Agilent G 4513A自动进样器和分流/不分离进样口,Agilent DB-5MS 毛细管柱(0.25 mm×30 m×0.25 μm),Agilent 色谱工作站和 NIST2008 质谱数据库。KQ-500DB型数控超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司);CS201-1C型电热鼓风干燥箱(重庆四达实验仪器厂);BP221S型电子天平[Mettler-Toledo Instr.(ShangHai) Ltd];TGL-16B型离心机(上海安亭科学仪器厂)。

2. 试剂

BSTFA(上海晶纯试剂有限公司,批号7807);N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺(MSTFA,Aladdin Chemistry Co. Ltd,批号19478);无水甲醇、氯仿[分析纯,利安隆博华(天津)医药化学有限公司];FFA标准品(德国Dr.Ehrenstorfer公司和Sigma公司)。

1. 标准品溶液的配制

精确称取各标准品5.0 mg,用甲醇定容为1 mg/mL的混合标准品储备液。

2. 样品制备方法

取3.0 mg血清冻干粉,加入300 μL甲醇和100 μL氯仿,超声10 min后1 500× g离心10 min,取上清液,氮气吹干后,加入30 μL BSTFA于70 ℃反应1 h,取1 μL反应液直接进样。

3. 色谱及质谱条件

进样口温度270 ℃;升温程序:80 ℃开始,以10 ℃/min升至245 ℃,以4 ℃/min升至280 ℃,溶剂延迟3 min;不分流进样;高纯氦气(99.999%)流速1.0 mL/min。离子源温度230 ℃,四级杆温度150 ℃。

采用Agilent 色谱工作站和 NIST2008 质谱数据库进行色谱数据的获取和处理。计量数据以 ±s表示,采用Excel和SPSS16.0软件进行数据处理。

结果

通过蛋白沉淀剂比例和用量的选择实验,最终确定了4倍(重量体积比)的甲醇∶氯仿(v/v=3∶1)作为血清冻干粉最佳预处理试剂。见图1:

图1

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	图1 蛋白沉淀剂选择

通过硅烷化试剂的选择,衍生化反应温度、时间的选择以及衍生化试剂用量的选择实验,最终确定30 μL BSTFA、70 ℃反应1 h的衍生化条件。见图2:

图2

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	图2 衍生化反应条件优化

标准品和加标血清中的11种FFA的色谱峰完全分离,峰形良好,血清中的杂质对于目标分析物无影响。

图3

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	图3 标准和加标血清样品色谱图

注:(a)标准品色谱图;(b)加标血清样品色谱图;1为壬酸;2为十二烷酸;3为十四烷酸;4为十六烷酸;5为十七烷酸;6为亚油酸;7为油酸;8为十八烷酸;9为花生四烯酸;10为花生五烯酸;11为二十烷酸

取不同浓度梯度的混合FFA标准工作液30 μL,干燥后加入30 μL BSTFA于70 ℃反应1 h。以峰面积( X)对标准品浓度( Y)进行线性回归分析,见表1:

表1

表1

表1 线性范围、标准曲线及检测限、定量限( n=5) FFA 线性范围(mg/mL) 标准曲线 相关系数 LODs(mg/mL) LOQs(mg/mL) 壬酸 0.004 9 ~0.980 Y=79 442 936X+412 744 0.999 2 0.001 5 0.004 9 十二烷酸 0.005 4 ~1.080 Y=119 546 077X-282 645 1.000 0 0.001 6 0.005 4 十四烷酸 0.005 0 ~1.000 Y=109 560 672X+115 475 0.999 8 0.001 5 0.005 0 十六烷酸 0.001 0 ~1.020 Y=140 204 126X+1 722 896 0.999 3 0.000 3 0.001 0 十七烷酸 0.004 9 ~0.980 Y=94 285 897X-318 780 0.999 1 0.001 5 0.004 9 亚油酸 0.520 0 ~10.400 Y=20 292 810X+3 391 217 0.999 4 0.156 0 0.520 0 油酸 0.005 4 ~1.080 Y=73 067 752X+987 989 0.999 8 0.001 6 0.005 4 十八烷酸 0.002 0 ~0.980 Y=132 019 921X+2 661 081 0.999 0 0.000 7 0.002 0 花生四烯酸 0.052 0 ~10.400 Y=22 614 101X-2 773 875 0.999 0 0.015 6 0.052 0 花生五烯酸 0.048 0 ~9.600 Y=21 074 014X-2 041 413 0.998 6 0.014 4 0.048 0 二十烷酸 0.005 1 ~1.020 Y=83 566 390X-781 759 0.999 3 0.001 5 0.005 1

表1 线性范围、标准曲线及检测限、定量限( n=5)

取0.1 mg/mL混合FFA标准工作液30 μL,干燥后加入30 μL BSTFA于70 ℃反应1 h,反应后0、2、4、6、8、24、48 h分别进样计算日内、日间精密度。结果见表2。

取0.1 mg/mL混合FFA标准工作液30 μL,加入到3.0 mg血清冻干粉中,再加入300 μL甲醇和100 μL氯仿,超声10 min后1 500× g离心10 min,取上清液,氮气吹干后加入30 μL BSTFA于70 ℃反应1 h,重复5次计算相对标准偏差( RSD)。结果见表2。

分别取1.0、0.5、0.1 mg/mL混合脂肪酸标准品30 μL,加入到3.0 mg血清冻干粉中,再加入300 μL甲醇和100 μL氯仿,超声10 min后1 500× g离心10 min,取上清液,氮气吹干后加入30 μL BSTFA于70 ℃反应1 h,计算回收率。结果见表2:

表2

表2

表2 精密度、重复性和加样回收率 FFA 日内精密度 [RSD(%)] 日间精密度 [RSD(%)] 重复性 [RSD(%)] 回收率(%) 0.1 mg/mL RSD(%) 0.5 mg/mL RSD(%) 1.0 mg/mL RSD(%) 壬酸 9.58 5.02 4.84 116.97 6.57 107.05 10.21 95.34 6.35 十二烷酸 8.86 0.75 5.68 118.00 3.91 90.65 5.97 97.78 2.97 十四烷酸 5.64 4.81 5.60 110.29 2.18 103.48 7.48 86.92 6.10 十六烷酸 6.70 5.47 9.40 78.64 7.80 80.16 3.81 81.34 9.94 十七烷酸 2.97 9.86 9.83 125.44 8.54 88.83 8.07 87.96 1.57 亚油酸 7.09 4.41 9.34 118.45 6.14 89.62 8.41 120.37 5.34 油酸 5.95 4.77 4.76 91.51 3.16 85.79 7.63 83.31 7.45 十八烷酸 3.62 7.53 5.94 89.16 8.79 76.16 4.84 86.64 1.80 花生四烯酸 3.43 8.38 2.57 109.51 8.77 114.72 2.57 106.61 4.08 花生五烯酸 4.95 8.22 3.14 111.90 9.98 123.39 12.96 114.52 9.49 二十烷酸 5.24 9.61 7.45 90.03 4.23 107.08 6.41 97.40 8.35

表2 精密度、重复性和加样回收率

精确称取冠心病患者血清冻干粉3.0 mg,加入300 μL甲醇和100 μL氯仿,超声10 min后1 500× g离心10 min,上清液经氮气吹干后加入30 μL BSTFA,70 ℃反应1 h,直接进样分析。结果见表3:

表3

表3

表3 冠心病患者血清中FFA含量测定结果 患者 编号 FFA(μg/mg) 二十烷酸 壬酸 十二烷酸 十四烷酸 十六烷酸 十七烷酸 亚油酸 油酸 十八烷酸 花生四烯酸 花生五烯酸 A 3.45 4.39 4.91 14.53 3.39 7.52 6.18 12.79 5.13 4.93 3.07 B 1.45 1.91 2.18 13.90 2.24 19.72 7.43 12.34 5.62 5.07 2.52 C 1.69 1.49 1.19 5.75 0.79 4.82 3.95 4.37 2.44 2.04 0.75 D 0.52 0.75 0.89 9.67 0.92 7.21 2.46 8.64 3.54 2.39 1.04 E 2.22 1.80 1.07 3.98 0.47 3.12 1.46 2.38 2.26 2.00 0.38 F 1.71 1.76 0.98 5.57 0.57 5.44 1.56 3.24 2.37 2.18 0.37 G 1.74 2.01 1.92 8.73 1.11 4.38 2.97 6.81 3.25 2.42 0.85 H 0.46 0.37 0.27 3.61 0.27 13.13 1.42 2.28 2.16 1.74 0.30 I 1.01 1.14 0.99 7.44 0.64 5.15 1.11 4.95 2.11 1.91 0.40 J 2.89 3.35 2.42 9.31 1.30 7.61 2.67 7.23 4.32 4.27 1.23 K 0.61 0.40 0.27 2.52 0.21 1.32 0.93 1.56 1.73 1.44 0.24

表3 冠心病患者血清中FFA含量测定结果

血清样品基质复杂,直接测定对其中的FFA干扰很大。本研究将血清低温制成冻干粉,一方面增强了血清样品储存过程中的稳定性,另一方面有助于祛除样品中的蛋白质,使与蛋白质结合的FFA得以释放。以甲醇、氯仿混合溶剂作为变性剂,能使蛋白成为绒毛状沉淀,离心后得到的上清液很澄清,且沉淀不容易挟走待测物,使得样品中的FFA提取完全。硅烷化作用是将FFA羧酸部分的活性氢被硅烷基取代,形成脂肪酸硅酯。由于硅烷化反应必须在无水条件下进行,在一定程度上制约该方法的应用。本研究将血清制成冻干粉,简化了实验过程并提高了反应效率。由于MSTFA反应产物对花生四烯酸和花生五烯酸的分离有干扰,而BSTFA的产物峰形相对较好,分离效果好,更利于气相色谱分析。本研究确定的色谱条件对于11种与疾病相关的常见FFA都能实现较好的基线分离,且峰形良好,血清中杂质对测定不产生干扰。在所测试的浓度范围内各FFA的线性关系良好,11种FFA的回收率均>75%,日内、日间精密度和重复性实验的相对标准偏差(RSD)均<10%。本研究通过选择合适的人血清样品前处理方法并优化衍生化反应条件,建立了同时测定冠心病患者血清中11种FFA含量的气相色谱质谱联用方法,该方法具有操作简单、灵敏度高、准确性好、线性范围宽等优点,为冠心病患者血清FFA检测提供了实验基础和依据。