引用本文
朱波, 赵惠柳, 王英, 劳明, 黄昭东, 刘志民, 谢娟, 欧超. 非小细胞肺癌KAI1基因和TIMP-1、MMP-9表达与临床生物学行为的关系研究 . 29(3): 0279-282[ZHU Bo, ZHAO Huiliu, WANG Ying, LAO Ming, HUANG Zhaodong, LIU Zhimin, XIE Juan, OU Chao. Research on the expressions ofKAI1 gene, TIMP-1 and MMP-9 and their correlations with clinicopathologic features of non-small cell lung cancer .Labratory Medicine, 29(3): 0279-282]  
Permissions
Copyright©2014, 《检验医学》编辑部
《检验医学》编辑部版权声明
非小细胞肺癌KAI1基因和TIMP-1、MMP-9表达与临床生物学行为的关系研究
朱波, 赵惠柳, 王英, 劳明, 黄昭东, 刘志民, 谢娟, 欧超
广西医科大学附属肿瘤医院检验科,广西 南宁 530021

朱波,男,1961年生,主任技师,主要从事肿瘤病因、机制及分子诊断研究。

欧超,联系电话:0771-5333422。

所有病例术后进行常规放疗和/或化疗,并追踪随访1年。每月采用电话或信访,术后每隔3个月复查计算机断层扫描,了解有无复发。73例患者中65例有随访资料,其中24例随访6个月出现复发,12例随访1年死亡。

摘要
目的

探讨KAI1基因和基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达,分析其与临床生物学行为的关系。

方法

应用免疫组化法检测73例NSCLC、51例相应的癌旁组织和13例非肿瘤性肺组织的KAI1和TIMP-1、MMP-9的表达,采用χ2检验和Pearson法分析三者与临床生物学行为的相关性。

结果

在73例NSCLC和64例癌旁及非肿瘤组织中,KAI1和TIMP-1的阳性率分别为39.7%、74.0%和90.6%、37.5%,两者比较差异有统计学意义(P<0.05),而MMP-9阳性率为79.4%和67.1%,两者比较差异无统计学意义(P>0.05)。在NSCLC组织中,KAI1检出率在不同TNM分期、淋巴结有无转移、不同肿瘤类型中差异有统计学意义(P<0.05),TIMP-1、MMP-9的检出率在不同TNM分期、淋巴结有无转移中差异有统计学意义(P<0.05),三者检出率与年龄、性别无关;KAI1的表达与TIMP-1、MMP-9呈负相关(r=-0.463 7、-0.344 5,P<0.05)。

结论

KAI1和TIMP-1、MMP-9均与肺癌的发展、转移有关,联合检测三者可成为评价NSCLC发生、发展的预后参考指标。

关键词: KAI1基因; 基质金属蛋白酶抑制剂1; 基质金属蛋白酶9; 肺肿瘤; 非小细胞性
中图分类号:R446.62 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2014)03-0279-04
Research on the expressions ofKAI1 gene, TIMP-1 and MMP-9 and their correlations with clinicopathologic features of non-small cell lung cancer
ZHU Bo, ZHAO Huiliu, WANG Ying, LAO Ming, HUANG Zhaodong, LIU Zhimin, XIE Juan, OU Chao
Department of Clinical Laboratory, the Affiliated Tumour Hospital of Guangxi Medical University, Guangxi Nanning 530021, China
Abstract
Objective

To investigate the expressions ofKAI1 gene, tissue inhibitor 1 of metalloproteinase (TIMP-1) and matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) in non-small cell lung cancer (NSCLC) and their correlations with clinicopathologic features of NSCLC.

Methods

The expressions ofKAI1, TIMP-1 and MMP-9 in 73 specimens of NSCLC tissues, 51 specimens of corresponding adjacent tissues and 13 specimens of non-cancerous lung tissue were determined by immunohistochemistry. Their correlations with clinicopathologic features were analyzed byχ2 test and Pearson analysis.

Results

In 73 specimens of NSCLC tissues and 64 cases of corresponding adjacent and non-cancerous lung tissues, the positive rates ofKAI1 and TIMP-1 were 39.7%, 74.0% and 90.6%, 37.5% with statistical significance (P<0.05), and the positive rates of MMP-9 were 79.4%, 67.1% without statistical significance (P>0.05). The expression ofKAI1 was correlated to TNM stage, lymph node metastasis, histologic subtype and differentiation with statistical significance (P<0.05), and the TIMP-1 and MMP-9 were correlated to TNM stage and lymph node metastasis (P<0.05), but they were not correlated to age and sex. The expression ofKAI1 was negatively correlated with the expressions of TIMP-1 and MMP-9 (r=-0.463 7, -0.344 5,P<0.05).

Conclusions

TheKAI1, TIMP-1 and MMP-9 are related to the development of lung cancer. The combination determination of them will be the important prognosis reference indicator for the occurrence and development of NSCLS.

Keyword: KAI1 gene; Tissue inhibitor 1 of metalloproteinase; Matrix metalloproteinase 9; Lung neoplasm; Non-small cell
引言

肺癌是当今世界上对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。侵袭转移是肺癌患者死亡的首要原因,是1个极其复杂的多基因调控和多步骤发展的过程,并涉及复杂的基因家族群参与的肿瘤转移相关基因的改变,相关基因起抑制肺癌转移或促进转移的作用[1]。 KAI1基因是肿瘤转移抑制基因[2],主要影响细胞间及细胞与细胞外基质间的信号传导。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)及其抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)在肿瘤的侵袭转移过程中发挥了重要作用,是目前研究的热点。我们采用SuperPicTure免疫组化法检测 KAI1和TIMP-1、MMP-9在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表达,以探讨它们对NSCLC生物学行为的影响,并分析临床病理因素与它们之间的相关性及临床意义。

材料和方法
一、临床资料

收集2007年8月至2009年6月广西医科大学附属肿瘤医院胸外科手术切除肺癌标本73例(经病理学检查确诊为原发性NSCLC)、相应的癌旁组织[距癌组织>3 cm,经苏木精-伊红(hematoxylin eosin, HE)染色证实无癌细胞浸润]51例和非肿瘤性肺组织标本13例(肺结核5例、支气管扩张4例、炎性假瘤4例)。患者年龄19~78岁,中位年龄56.5岁。腺癌32例(高分化19例、低分化13例),鳞癌41例(高分化19例、中分化16例、低分化6例),依据1997年国际抗癌联盟TNM分期标准,Ⅰ期41例、Ⅱ期19例、Ⅲ期13例。所有患者术前均末接受化疗、放疗及其他抗癌治疗。KAI1抗体购自美国Santa Cruz公司,TIMP-1和MMP-9单克隆抗体购自美国LabVision-NeoMarkers公司,二抗SuperPicTure试剂盒、二氨基联苯胺显色剂均为美国Zymed公司产品。

二、方法

所有手术标本用10%中性甲醛溶液固定,石蜡包埋,制成厚4 μm的切片,采用免疫组化SuperPicTure法进行KAI1和TIMP-1、MMP-9染色。按SuperPicTure试剂盒操作说明进行,主要步骤如下:切片脱蜡至水,高压修复1.5 min,阻断内源性过氧化物酶20 min,正常非免疫血清封闭30 min,滴加Ⅰ抗在室温孵育1 h,滴加50 μL酶标抗鼠/兔聚合物,室温孵育30 min;新鲜二氨基联苯胺-H2O2溶液显色,苏木精复染。用已知阳性反应片作阳性对照,阴性对照采用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)替代Ⅰ抗进行同步染色。KAI1和TIMP-1、MMP-9工作液浓度分别为1∶150、1∶50、1∶100。

三、结果判断

免疫组织化学结果显示肺癌细胞中KAI1蛋白的阳性着色主要表现为细胞浆和/或细胞膜阳性,呈弥漫性分布,TIMP-1蛋白的阳性着色为细胞浆和胞膜内阳性,MMP-9蛋白的阳性着色为细胞膜阳性。染色结果观察采用双盲法,由2位病理科医生在不知病理分级与临床资料的情况下读片,每张切片观察5个视野(400倍)计算阳性细胞数,计算总细胞数不少于1 000个,按阳性细胞所占百分数分为:阳性细胞率<5%为阴性(-);5%~24%为弱阳性(+);25%~50%为阳性(++);>50%为强阳性(+++)。

四、统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行 χ2检验,相关分析采用Pearson法, P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、随访

所有病例术后进行常规放疗和/或化疗,并追踪随访1年。每月采用电话或信访,术后每隔3个月复查计算机断层扫描,了解有无复发。73例患者中65例有随访资料,其中24例随访6个月出现复发,12例随访1年死亡。

二、 KAI1和TIMP-1、MMP-9的表达情况

KAI1阳性染色定位于细胞浆和/或细胞膜中,阳性细胞染色呈散在或片状分布,见图1;73例NSCLC中有29例阳性,阳性率为39.7%;在64例癌旁组织及非肿瘤性肺组织中有58例阳性,阳性率为90.6%。两者比较差异有统计学意义( P<0.05)。

TIMP-1蛋白阳性染色定位于细胞浆和细胞膜内,呈弥漫性分布;MMP-9定位于肿瘤细胞核和细胞浆,棕褐色颗粒状或团块状着色,间质的纤维细胞也呈MMP-9 弱阳性,见图1:

图1 KAI1和TIMP-1、MMP-9在NSCLC 组织中的表达(SuperPicTure×400)

注:(a) KAI1阳性染色定位于细胞质或细胞膜;(b)TIMP-1阳性染色定位于细胞浆或细胞膜;(c)MMP-9阳性染色定位于细胞核或细胞质

NSCLC中TIMP-1和MMP-9的阳性率分别为74.0%、79.4%,与相应癌旁组织及非肿瘤性肺组织中阳性率(37.5%、67.1%)相比,TIMP-1在NSCLC的阳性表达率明显高于癌旁组织,差异有统计学意义( P<0.05)。NSCLC标本MMP-9蛋白阳性表达率高于癌旁组织,但差异无统计学意义( P>0.05)。

三、 KAI1和TIMP-1、MMP-9在NSCLC表达的相关性

在29例 KAI1阳性表达的NSCLC组织中18例呈TIMP-1阳性表达,占54例TIMP-1阳性表达的33.3%(18/54);20例呈MMP-9阳性表达,占58例MMP-9阳性表达的34.5%(20/58); KAI1与TIMP-1阳性表达密切相关( r=-0.463 7, P=0.002 2),与MMP-9的阳性表达也密切相关( r=-0.344 5, P=0.027 3),呈负相关。

四、 KAI1和TIMP-1、MMP-9的表达与临床生物学行为的关系

73例NSCLC患者按年龄、性别、肿瘤类型及分化程度、TNM分期、淋巴结转移分组。 KAI1和TIMP-1、MMP-9在NSCLC组织中的检出率与TNM分期、淋巴结转移明显相关( P<0.05),与年龄、性别无关; KAI1的检出率与肿瘤类型也明显相关( P<0.05),而TIMP-1和 MMP-9的检出率与肿瘤类型无明显关系。见表1:

表1 KAI1和TIMP-1、MMP-9在NSCLC中阳性率与临床生物学行为的关系[例(%)]
讨论

肺癌是目前对人类健康与生命威胁最大的恶性肿瘤之一,近半个世纪以来其发病率和死亡率均呈上升趋势。影响肺癌患者疗效和导致死亡的最主要原因是肺癌的侵袭与转移[1]。 KAI1基因是最近发现的与肿瘤转移抑制相关的基因,该基因定位于人染色体11p11.2,全长约80 kb,包括10个外显子与9个内含子[2]。TIMP是一类相对分子质量较低的蛋白酶家族,属分泌蛋白类,目前已鉴定出4个成员,即TIMP-1、2 、3 、4[3],他们分别定位于人Xp11.3Xp11.23、17q25、22q12.1q13.2及3p25。MMP属于锌肽酶超家族,几乎可降解细胞外基质的所有成分[4],TIMP分子结构上存在功能不同的N端和C端,前者是抑制MMP关键部位;后者则在蛋白定位以及与MMP前体结合成复合物的过程中起关键作用。它们在肿瘤的侵袭转移过程中发挥了重要作用。目前的研究显示, KAI1基因的抑制转移机制较为复杂,多种说法不一。有研究表明KAI1蛋白定位于细胞与细胞交界的细胞膜上,间质成分不表达,提示KAI1参与了细胞间及细胞与胞外基质间的反应[5]。这种反应可能介导了细胞与环境间的信号传递,从而影响细胞的运动和分化,影响肿瘤细胞的浸润和转移。 KAI1基因的低表达与细胞间粘附作用减弱、细胞与胞外基质粘附作用减弱、体内外侵袭能力增强密切相关[6],但目前有关这些效应的分子机制仍不甚清楚。本研究表明KAI1在NSCLC和癌旁组织及非肿瘤性肺组织中表达率为39.7%和90.6%,两者比较差异有统计学意义( P<0.05)。 KAI1在NSCLC中的表达表现为下调,同时与淋巴结转移、TNM分期有关( P<0.05),与年龄、性别无关,提示 KAI1基因的高表达具有抑制肿瘤转移的作用,而一旦无法保持 KAI1基因的高表达,则肿瘤进入进展期并开始发生侵袭和转移,说明 KAI1基因可能对NSCLC的浸润和转移有抑制作用。本研究发现,NSCLC中TIMP-1、MMP-9的阳性率分别为74.0%、79.4%,明显高于相应癌旁组织及非肿瘤性肺组织的阳性率(37.5%、67.1%)( P<0.05);而NSCLC标本MMP-9蛋白阳性表达率高于癌旁组织,但差异无统计学意义( P>0.05)。进一步的研究发现TIMP-1、MMP-9在NSCLC中的表达表现为上调,同时与淋巴结转移、TNM分期有关( P<0.05),与年龄、性别无关。TIMP与MMP的相对水平才是其中的决定性因素,两者间的精细平衡在维系健康组织的完整性、调控肿瘤诱导的血管发生、基底膜降解、炎症反应及慢性退行性病变这些病理生理过程中都发挥了重要作用[7,8]。因此,这些分子之间的相互作用关系有可能是 KAI1具有转移抑制功能的关键原因。

本研究发现 KAI1的检出率与肿瘤类型明显相关( P<0.05),而TIMP-1和 MMP-9的检出率与肿瘤类型无明显关系,进一步的研究发现 KAI1与TIMP-1、MMP-9在NSCLC表达密切相关(负相关),这与Jee等[9]在肿瘤细胞系的研究相一致,即将 KAI1基因转染至人NSCLC细胞株H1299中获取过表达 KAI1的转染细胞株,并对后者的侵袭转移性及相关分子事件进行研究,发现在转染细胞株中,MMP-9的mRNA和蛋白表达水平均上升,但酶活性下降。此外,还发现TIMP-1的表达水平亦有上升,认为 KAI1可能是通过上调TIMP-1导致MMP-9失活,进而抑制了肺癌细胞株H1299的侵袭转移潜力。霍小森等[10]研究结果发现KAI1蛋白表达可作为NSCLC预后的指标,对临床预测NSCLC转移具有一定指导意义。临床研究表明,包括肺癌在内,许多晚期转移性癌症中都有 KAI1基因表达下调或缺失的事件发生[11]。提示 KAI1的异常表达与肺癌的浸润转移有关,对肺癌的发生、发展有重要预测作用。

总之, KAI1在NSCLC中低表达,相反TIMP-1、MMP-9在NSCLC中高表达,三者不同程度地与淋巴结转移、TNM分期、肿瘤类型有关, KAI1与TIMP-1、MMP-9之间存在负相关关系,提示 KAI1可能通过上调TIMP-1、MMP-9的表达促进肺癌的发展。说明三者与肺癌的发展有关,可成为评价预后的参考指标,联合检测三者对判断肺癌的组织分化、恶性程度有指导意义。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Steeg PS. Metastasis suppressors alter the signal transduction of cancer cells[J]. Nat Rev Cancer, 2003, 3(1): 55-63. [本文引用:2] [JCR: 35.0]
[2] Dong JT, Lamb PW, Rinker-Schaeffer CW, et al. KAI1, a metastasis suppressor gene for prostate can-cer on human chromosome 11p11. 2[J]. Science, 1995, 268(5212): 884-886. [本文引用:2]
[3] Liu H, Chen B, Lilly B. Fibroblasts potentiate blood vessel formation partially through secreted factor TIMP-1[J]. Angiogenesis, 2008, 11(3): 223-234. [本文引用:1] [JCR: 3.972]
[4] Martin MD, Matrisian LM. The other side of MMPs: protective roles in tumor progression[J] . Cancer Metastasis Rev, 2007, 26(3-4): 717-724. [本文引用:1] [JCR: 7.787]
[5] Mu Z, Wang H, Zhang J, et al. KAI1/CD82 suppresses hepatocyte growth factor-induced migration of hepatoma cells via upregulation of Sprouty 2[J]. Science China C Life Sci, 2008, 7(51): 648-654. [本文引用:1]
[6] Kauffman EC, Robinson VL, Stadler WM, et al. Metastasis suppression: the evolving role of metastasis suppressor genes for regulating cancer cell growth at the secondary site[J]. J Urol, 2003, 169(3): 1122-1133. [本文引用:1] [JCR: 0.742]
[7] Omura K, Takahashi M, Omura T, et al. Changes in the concentration of plasma matrix metalloproteinases(MMPs) and tissue inhibitor of metalloproteinases-1(TIMP-1) after total joint replacement in patients with arthritis[J]. Clin Rheumatol, 2002, 21(6): 488-492. [本文引用:1] [JCR: 2.037]
[8] 蔡铭, 翁鸢, 王志强, 等. 基质金属蛋白酶在早期肺癌中的表达[J]. 中华实验外科杂志, 2010, 27(5): 612-613. [本文引用:1]
[9] Jee BK, Park KM, Surendran S, et al. KAI1/CD82 suppresses tumor invasion by MMP9 inactivation via TIMP1 up-regulation in the H1299 human lung carcinoma cell line[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 342(2): 655-661. [本文引用:1] [JCR: 2.406]
[10] 霍小森, 孟令新, 张逊. 基质金属蛋白酶及其抑制剂在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义[J]. 中华肿瘤防治杂志, 2007, 14(10): 758-761. [本文引用:1]
[11] Ow K, Delprado W, Fisher R, et al. Relationship between expression of the KAI1 metastasis suppressor and other markers of advanced bladder cancer[J]. J Pathol, 2000, 191(1): 39-47. [本文引用:1] [JCR: 7.585]