引用本文
郭永红, 周云, 张颖, 何瑜, 纪光晰, 马志远, 成程, 范超, 张凌云, 贾战生. 慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者Th1/Th2细胞的细胞因子变化及与肝功能指标的关系. 29(3): 274-278[GUO Yonghong, ZHOU Yun, ZHANG Ying, HE Yu, JI Guangxi, MA Zhiyuan, CHENG Cheng, FAN Chao, ZHANG Lingyun, JIA Zhansheng. The cytokine changes of Th1/Th2 in patients with acute-on-chronic hepatitis B liver failure and their relationships with liver function parameters.Labratory Medicine, 29(3): 274-278]  
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慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者Th1/Th2细胞的细胞因子变化及与肝功能指标的关系
郭永红1, 周云1, 张颖1, 何瑜1, 纪光晰1, 马志远1, 成程1, 范超1, 张凌云2, 贾战生1
1. 第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心,陕西 西安 710038
2.河南新乡医学院感染科,河南 新乡 453000

郭永红,女,1971年生,博士,副主任医师,主要从事病毒性肝炎、肝硬化的发病机制研究。

贾战生,联系电话:029-84777452。

基金:国家“十二五”艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治项目(2012ZX10002007-002-010);
摘要
目的

利用流式细胞微球芯片捕获技术(CBA)检测慢加急性乙型肝炎肝衰竭(ACHBLF)患者辅助性T细胞1/2(Th1/Th2)分泌的细胞因子水平,探讨其在ACHBLF中变化的意义。

方法

收集33例ACHBLF、20例慢性乙型肝炎(CHB)患者血清及15名健康志愿者血清,CBA检测血清Th1/Th2细胞因子γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平,分析Th1/Th2细胞因子在ACHBLF患者血清中的变化。

结果

ACHBLF患者外周血循环中TNF-α、IFN-γ、IL-4及IL-6的水平较CHB患者及健康对照者显著升高(P< 0.05);ACHBLF患者血清中IL-2及IL-10与CHB组和健康对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。ACHBLF患者血清中IL-4、IL-6、TNF-α及IFN-γ水平与总胆红素(TBil)、白蛋白(Alb)和凝血酶原活动度(PTA)间无明显相关性。

结论

CBA可同时检测各种细胞因子,适合临床应用;ACHBLF患者TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-6的变化可能参与ACHBLF的发生和发展,未发现上述细胞因子与反映肝功能指标间的相关关系。

关键词: 细胞因子; 辅助性T细胞1/2; 流式细胞微球芯片捕获技术; 乙型肝炎; 重症肝炎
中图分类号:R446.63 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2014)03-0274-05
The cytokine changes of Th1/Th2 in patients with acute-on-chronic hepatitis B liver failure and their relationships with liver function parameters
GUO Yonghong1, ZHOU Yun1, ZHANG Ying1, HE Yu1, JI Guangxi1, MA Zhiyuan1, CHENG Cheng1, FAN Chao1, ZHANG Lingyun2, JIA Zhansheng
1.Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases,Tangdu Hospital of Fourth Military Medical University,Shanxi Xi′an 710038,China;
2.Department of Infection,Xinxiang Medical College, Henan Xinxiang 453000,China
Abstract
Objective

To investigate the cytokine levels of T helper cell 1/2 (Th1/Th2) detected by cytometric bead array (CBA) in patients with acute-on-chronic hepatitis B liver failure (ACHBLF), and their change significance in ACHBLF.

Methods

The Th1/Th2 cytokine levels in 33 patients with ACHBLF and 20 patients with chronic hepatitis B (CHB) were detected by CBA. A total of 15 healthy subjects were enrolled as controls. The serum interferon gamma (IFN), interleukin 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4), interleukin 6 (IL-6), interleukin 10 (IL-10) and tumor necrosis factor alpha (TNF-α) levels were detected, and the changes of Th1/Th2 cytokine levels were analyzed.

Results

The serum TNF-α, IFN-γ, IL-4 and IL-6 levels of ACHBLF group were significantly higher than those of CHB and control groups (P<0.05).The serum IL-2 and IL-10 had no statistical significance between ACHBLF and CHB groups and between ACHBLF and control groups (P>0.05) . There was no significant correlation of IL-4, IL-6, TNF-α in ACHBLF group with total bilirubin (TBil), albumin (Alb) and prothrombin activity (PTA).

Conclusions

CBA can determine a variety of cytokines simultaneously and is suitable for the clinical application. The changes of TNF-α, IFN-γ, IL-4 and IL-6 will involve to the pathogenesis and development of ACHBLF. There is not found the relationship between cytokines and liver function.

Keyword: Cytokine; T helper cell 1/2; Cytometric bead array; Hepatitis B; Severe hepatitis
引言

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)所致的急性肝衰竭,即慢加急性乙型肝炎肝衰竭(acute-on -chronic hepatitis B liver failure ACHBLF),属于慢性乙型重型肝炎的范畴。ACHBLF在慢性重型肝炎中占多数,起病较急,预后凶险,病死率高达70%[1]。ACHBLF的发病机制极为复杂,其中病毒感染启动的机体各种免疫和炎症应答占据了重要地位,但具体机制尚未完全阐明[2,3]。

辅助性T细胞(helper T cell,Th)通过辅助或诱导其它免疫细胞活化,在机体适应性免疫应答中发挥关键作用。Th细胞根据其分泌的细胞因子不同可分为Th1和Th2细胞亚群,正常机体Th1/Th2类细胞因子处于平衡状态,病理情况下出现失衡。有研究表明,Th1/Th2失衡在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)持续感染及介导肝细胞免疫损伤中起重要作用[4]。目前对于ACHBLF 患者外周血中Th1/Th2细胞因子的研究较少,且多数采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测。该法虽操作简单、经济,但1次只能检测1种细胞因子,样本需求量大,无法反映细胞因子之间的关系。流式细胞微球芯片捕获技术(cytometric bead array,CBA)可以同时检测多重细胞因子,精确性高、可重复性好、高通量,具有较好的精确度和敏感性[5]。本研究利用CBA检测ACHBLF患者外周血Th1/Th2细胞因子表达水平,探讨ACHBLF Th1/Th2细胞因子的变化及其与若干肝功能衰竭指标的关系。

材料和方法
一、研究对象

收集2012年8至12月在唐都医院感染科就诊的ACHBLF患者33例,其中男28例,女5例,年龄(44.3±4.3)岁,诊断符合2012年版《肝衰竭诊疗指南》[1]。CHB患者20例,其中男16例,女4例,年龄(40.1±3.7)岁,所有患者入院次日清晨取空腹静脉血检测肝功能、血液学、HBV血清学标志物、HBV DNA等相关指标。排除标准为合并甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒等感染,酒精性肝病,药物性肝病,自身免疫性疾病和恶性肿瘤。另取15名健康志愿者血清作为健康对照,其中男7名,女8名,年龄(35.1±9.3)岁。本研究经唐都医院医学伦理委员会批准,并获所有研究对象知情同意。

二、临床指标检测

丙氨酸氨基转移酶 (alanine aminotransferase,ALT)、总胆红素(total bilirubin, TBil)、白蛋白(albumin, Alb)、凝血酶原活动度(prothrombin activity, PTA)等指标均在唐都医院临床检验中心进行检测,免疫生化指标采用全自动生化仪检测。HBV血清学标志物、HBV DNA 检测均在本科实验室进行。

三、仪器与试剂

FACS AriaⅡ流式细胞仪(美国BD公司)及其CellQuest分析软件和BD CBA数据分析软件。CBA磁珠检测盒购自美国BD公司。

四、CBA

按说明书进行操作:试剂盒提供的Th1/Th2 细胞因子冻干标准品溶解于2.0 mL稀释液,室温平衡15 min后进行稀释。采用倍比稀释,取300 μL标准品溶液加入300 μL稀释液,并吹打混匀,即为1∶2 倍稀释。依次进行1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256 及1∶512倍稀释。6 种细胞因子捕获磁珠等体积混合、震荡, 取50 μL混合的Th1/Th2 细胞因子捕获磁珠于分析管中。依次加入50 μL藻红蛋白(phycoerythrin,PE)标记的检测试剂、50 μL标准品或50 μL待检血清样本,震荡混匀后室温避光3 h。加1 mL洗液,200× g 离心5 min。加300 μL洗液悬浮磁珠,上流式细胞仪前各样本振荡3~5 s。采用CellQuest软件分析并采集分析图谱,再用BD FACSComp 软件分析换算成浓度。

五、统计学方法

采用GraphPad Prism 5软件进行统计分析。正态分布计量资料采用 ±s表示,组间比较采用ANOVA方差分析,细胞因子与临床指标的相关性分析用Pearson方法。 P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、患者及健康对照者临床基本资料

收集患者及健康对照者的临床基本资料,包括年龄、性别、临床症状及生化检查等情况,见表1:

表1 患者及健康对照者临床基本资料( ±s)
二、CHB、ACHBLF患者和健康对照者血清Th1/Th2细胞因子水平的变化

标准品终浓度分别为2 500 ~0 pg/mL共9个浓度点,整个过程均在计算机中处理,曲线拟合适配度(R Square)均在95%以上,标准曲线见图1:

图1 Th1/Th2细胞因子标准品拟合曲线

注:af图分别为IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和TNF-α标准品拟合曲线

ACHBLF患者血清中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、γ干扰素(interferon gamma,IFN-γ)、白细胞介素4(interleukin 4,IL-4)及白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)的水平较CHB患者及健康对照者显著升高( P<0.05),见图2、图3和表2:

图2 CBA检测不同患者及健康对照者细胞因子流式图

注:a图为ACHBLF; b图为CHB;c图为健康对照;PE为藻红蛋白;APC为别藻蓝蛋白

图3 CBA 检测ACHBLF、CHB患者和健康对照者血清IL-4、IL-6、IFN-γ及TNF-α的统计图

注:(a)(d)分别为IL-A、IL-6、IFN-γ和TNF-α;* P<0.05;ns表示差异无统计学意义

表2 CHB、ACHBLF患者及健康对照者外周血中Th1/Th2细胞因子表达水平比较( ±s,pg/mL)

注:与健康对照组比较,* P<0.05;与CHB组比较,# P<0.05

然而,白细胞介素2(interleukin 2,IL-2)、白细胞介素10(interleukin 10,IL-10)水平与CHB组和健康对照组比较,差异无统计学意义( P>0.05)。CHB组血清中细胞因子水平与健康对照组比较,差异无统计学意义( P>0.05)。

三、ACHBLF患者血清中TNF-α、IFN-γ及IL-4、IL-6与TBil、Alb及PTA相关性分析

ACHBLF患者血清中IL-4、IL-6、TNF-α及IFN-γ水平与反映肝功能的指标均无明显相关性( P>0.05)。见表3:

表3 ACHBLF患者血清中IL-4、IL-6、TNF-α及IFN-γ与TBil、Alb及PTA相关系数 r值
讨论

细胞因子是由机体的免疫细胞、非免疫细胞合成和分泌的多肽类小分子,它们在调节机体抵抗外源性及内源性抗原时起重要作用。检测细胞因子的技术大致可分为3类:(1)生物活性检测法;(2)免疫学细胞因子直接定量法;(3)分子杂交检测法。因分子杂交检测法及生物活性检测法所要求的实验室条件较高,目前多数采用ELISA。该法虽操作简单、经济,但1次只能检测1种细胞因子,样本需求量大。CBA是基于流式细胞仪检测平台的液相多重蛋白定量技术,基本原理为:首先将不同捕获抗体包被在不同荧光强度的微球上形成捕获微球,然后和待测样本溶液混合,微球上的特异性抗体就与样本(血清、血浆或细胞培养液)中相应的抗原或蛋白结合,再加入荧光标记的检测抗体,形成“三明治”夹心复合物,最后上流式细胞仪进行检测。CBA使用具有不同荧光强度的微球群,分别包被针对不同抗体的特异性捕获抗体,因此可以同时检测多种蛋白,较传统的ELISA有较大优势,所需样本体积仅为传统ELISA分析所需样本量的1/6,稳定性好,能避免由于酶联放大技术使信号失真导致的假阳性。

HBV感染进入机体后,机体通过免疫应答抵御病毒的入侵。T淋巴细胞是病毒感染诱导机体产生特异性免疫应答中最重要的效应器,T淋巴细胞在受到病毒抗原刺激后,分化为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T cell,CTL)和Th。CTL一方面通过直接溶解受感染的细胞来清除病毒,但更主要的是通过分泌IFN-γ、TNF-α等细胞因子介导非溶解细胞的途径来清除病毒[6,7] 。Th1细胞主要产生IFN-γ和IL-2等细胞因子,Th1细胞反应占优势时,有利于病毒的完全清除。Th2 细胞主要分泌IL-4、IL-10 等细胞因子,这些因子可以抑制Th1型细胞因子的产生,并介导体液免疫。Th2免疫占优势时,可以导致病毒感染的慢性化。重症肝炎患者受病毒攻击及机体免疫应答异常,表现为单核-巨噬细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞活性增高,体液免疫功能亢进等。同时,可诱导CTL的增殖分化,促进肝组织内大量炎症细胞浸润,特别是中性粒细胞,造成了大量肝细胞坏死[8]。

IFN-γ在重症肝炎致病机制中起非常重要的作用[9]。重症肝炎患者血清IFN-γ表达水平较高是Th1优势应答的结果;TNF-α是枯否细胞分泌的最重要的细胞因子,是引发肝坏死最直接的原因。在重症肝炎时,TNF-α不仅促使中性粒细胞的黏附,引起内皮细胞损伤,还可通过细胞免疫包括激活CTL免疫杀伤作用或激活体内单核细胞产生内源性TNF-α,共同参与急性肝坏死的发生[10]。本研究证实在健康对照组及CHB组患者血清中IFN-γ及TNF-α的表达水平非常低,而在ACHBLF 组患者TNF-α和IFN-γ水平显著升高,分析其原因可能为重症肝炎时T细胞为了清除病毒的感染,分泌较多的IFN-γ及TNF-α,造成大量肝细胞破坏,同时HBV DNA水平亦下降。另外1种可能是TNF-α是促炎因子,ACHBLF患者易合并感染,可诱发TNF-α进一步升高。TNF-α、IL-4 是相互调节的细胞因子,二者共同作用介导炎症的发展,TNF-α和IL-4 的升高可反映出局部和全身感染的存在。本研究证实重症肝炎时IL-6及IL- 4升高,与TNF-α趋势相同,其原因可能是发生了促炎症因子的级联瀑布效应,促炎症因子升高诱发免疫抑制性细胞因子同时升高,也可能与重症肝炎患者多合并局部或全身感染有关,还需进一步与感染相关指标结合动态观察。

本研究通过CBA检测Th1/Th2细胞因子,分析其与肝功能衰竭的指标包括TBil、Alb及凝血因子全套等指标的相关性,结果显示其统计学并无很强的相关性( P>0.05),有待于进一步增加病例数加以验证。而Th1/Th2变化结果并不完全符合此消彼长的规律,分析原因可能是机体启动了不可逆的免疫反应,免疫抑制性细胞因子和促炎细胞因子同时处于高水平,上述假设是否成立仍需在以后的研究中扩大病例数进行观察。同时CBA的敏感性和特异性还需进一步分析验证。

外周血中的细胞因子是多源性的,其表达水平并不能直接说明肝脏微环境中Th1/Th2细胞因子的变化状况,本研究因取材限制仅分析外周血中细胞因子的变化,未能同时分析肝脏组织Th1/Th2细胞因子表达状况,因此有待于进一步检测肝脏组织Th1/Th2细胞因子的表达以更加真实地反映重症肝炎患者细胞因子变化。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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