引用本文
罗光成, 黄云丽, 闫惠平, 冯霞, 林 芳, 凡瞿明, 张国元. HBV相关慢加急性肝衰竭患者血清细胞因子水平与疾病预后的关系研究. 检验医学, 2014, 29(1): 26-30[LUO Guangcheng, HUANG Yunli, YAN Huiping, FENG Xia, LIN Fang, FAN Quming, ZHANG Guoyuan. Research on the relationship between serum cytokine levels and prognosis in patients with HBV-related acute-on-chronic liver failure. Labratory Medicine, 2014, 29(1): 26-30]  
Permissions
HBV相关慢加急性肝衰竭患者血清细胞因子水平与疾病预后的关系研究
罗光成1, 黄云丽2, 闫惠平2, 冯霞2, 林 芳1, 凡瞿明1, 张国元1
1.川北医学院附属医院检验科, 四川 南充 637000
2.首都医科大学附属北京佑安医院感染与免疫研究中心, 北京 100069
基金:北京市自然科学基金资助项目 (7111004)
摘要
目的 观察乙型肝炎病毒 (HBV) 相关慢加急性肝衰竭 (ACLF) 患者血清细胞因子水平的变化, 探讨细胞因子在疾病预后中的作用。方法 收集HBV相关ACLF患者24例 (治愈者13例, 死亡者11例) 、慢性乙型肝炎 (CHB) 患者30例和正常对照者15名, 采用 Luminex 液相芯片技术检测血清白细胞介素IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、粒细胞-巨噬细胞刺激因子 (GM-CSF) 、γ干扰素 (IFN-γ) 和肿瘤坏死因子α (TNF-α) 等细胞因子水平, 并结合临床指标进行相关分析。结果 ACLF组IL-6、IL-8和TNF-α水平高于CHB组和对照组(P<0.01),CHB组亦高于对照组(P<0.05);ACLF死亡组IL-6、TNF-α水平和终末期肝病模型 (MELD) 评分明显高于治愈组(P<0.05);TNF-α、IL-6与凝血酶原活动度 (PTA) 之间呈明显负相关(r=－0.712,P<0.001;r=－0.521,P=0.009);TNF-α、IL-6与MELD评分之间呈明显正相关(r=0.491,P<0.015;r=0.379,P=0.048) 。细胞因子与HBV DNA和乙型肝炎表面抗原 (HBsAg) 之间无明显相关性。结论 HBV相关ACLF患者血清中多种细胞因子明显升高, 其中IL-6和TNF-α水平随疾病严重程度的增加而增加, 检测其血清细胞因子水平有助于疾病严重程度和预后转归的判断。
关键词: 细胞因子; 白细胞介素6; 肿瘤坏死因子α; 慢加急性肝衰竭
Research on the relationship between serum cytokine levels and prognosis in patients with HBV-related acute-on-chronic liver failure
LUO Guangcheng1, HUANG Yunli2, YAN Huiping2, FENG Xia2, LIN Fang1, FAN Quming1, ZHANG Guoyuan1
1.Department of Clinical Laboratory, Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Sichuan Nanchong 637000, China
2. Center of Infection and Immunity, Beijing You′an Hospital, Capital Medical University, Beijing 100069, China
Abstract
Objective To observe the changes of serum cytokine levels in patients with hepatitis B virus (HBV)-related acute-on-chronic liver failure (ACLF), and investigate the role of cytokines in the prognosis of HBV-related ACLF.Methods A total of 24 HBV-related ACLF patients (13 cured cases and 11 dead cases), 30 patients with chronic hepatitis B (CHB) and 15 healthy controls were enrolled. The serum levels of interleukin (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), gamma interferon (IFN-γ) and tumor necrosis factor alpha (TNF-α) were detected by Luminex liquid chip technology, and the relative results were analyzed.Results The levels of IL-6, IL-8 and TNF-α in ACLF group were higher than those in CHB group and healthy control group (P<0.01), and those in CHB group were higher than those in healthy control group (P<0.05). IL-6, TNF-α and model for end stage liver disease (MELD) score in ACLF dead group were significantly higher than those in ACLF cured group(P<0.05). The levels of TNF-α and IL-6 were negatively correlated with prothrombin activity (PTA)(r=－0.712,P<0.001;r=－0.521,P=0.009). Furthermore, the levels of TNF-α and IL-6 were positively correlated with MELD score(r=0.491,P<0.015;r=0.379,P=0.048). There was no correlation among cytokines, HBV DNA and hepatitis B surface antigen (HBsAg).Conclusions In HBV-related ACLF patients, various serum cytokines increase significantly. Furthermore, the levels of IL-6 and TNF-α increase with the severity of disease, and they are helpful in disease progression and prognosis.
Keyword: Cytokine; Interleukin 6; Tumor necrosis factor alpha; Acute-on-chronic liver failure

慢加急性肝衰竭 (acute-on-chronic liver failure, ACLF) 是在慢性肝病的基础上, 短期内出现以黄疸和凝血功能障碍为主要临床表现的急性肝脏损伤。我国乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus, HBV) 感染率较高, HBV感染是肝衰竭的首要原因。在肝衰竭发生过程中肝组织依次经受了免疫损伤、缺血缺氧性损伤和内毒素血症的三重打击, 其中免疫损伤在肝衰竭发生中起着至关重要的作用。细胞因子在免疫反应和炎症反应中起着重要的作用, 与肝衰竭过程中的肝细胞坏死和疾病临床预后密切相关, 如肿坏死因子α (tumor necrosis factor-alpha, TNF-α) 、白细胞介素 (interleukin, IL)-6和γ干扰素 (interferon-gamma, IFN-γ) 等[ 1, 2, 3, 4, 5]。尽管越来越多的证据表明, 细胞因子在ACLF的发生、发展中起了重要的作用, 但其与疾病预后的关系仍未完全阐明。我们采用Luminex技术检测HBV相关ACLF患者血清多项细胞因子, 以观察ACLF患者血清细胞因子的变化情况, 并探讨细胞因子在临床转归中的作用。

材料和方法
一、研究对象

收集2011年1月至2012年2月期间北京佑安医院收治的HBV相关ACLF患者24例 (治愈者13例, 即症状体征明显好转或消失, 肝功能转至正常的患者;死亡者11例, 包括宣布临床死亡和经专家评估无治愈可能而放弃治疗的患者),ACLF诊断符合2006年《肝衰竭诊疗指南》;收集同期住院的慢性乙型肝炎 (chronic hepatitis B, CHB) 患者30例, CHB诊断符合2010版《慢性乙型肝炎防治指南》。同时设健康对照15名。全部病例均排除其他嗜肝病毒重叠感染、人类免疫缺陷病毒感染和严重细菌、真菌感染, 排除自身免疫性、酒精性、药物性、脂肪性等其他因素引起的肝损伤, 既往或近期未使用免疫抑制剂治疗。本研究得到了北京佑安医院伦理委员会的支持, 所有研究对象均签署了知情同意书。终末期肝病模型 (model for end-stage liver disease, MELD) 公式:r=3.8 lnTBil (mg/dL)+11.2ln (INR)+9.6lnCRE (mg/dL)+6.4 (病因:胆汁性或酒精性0, 其他1)[ 6],公式中ln为自然对数natural logarithm的缩写。3组对象的基本信息见表1。3组间年龄性别基本一致, ACLF组丙氨酸氨基转移酶 (alanine aminotransferase, ALT) 和天门冬氨酸氨基转移酶 (aspartate aminotransferase, AST) 明显高于CHB组和对照组(P<0.01) 。

表1 各组研究对象的一般情况
注:与对照组比较,*P<0.01;与CHB组比较,#P<0.01.

二、Luminex检测多项细胞因子

采集患者入院时的外周血样本并及时分离血清, 检测其IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、粒细胞-巨噬细胞刺激因子 (granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF) 、IFN-γ和TNF-α浓度。取出Bio-Plex多细胞因子检测试剂盒 (美国BIO-RAD公司) 平衡至室温, 按试剂说明书稀释样本、标准品、抗体包被微球、生物素标记的检测抗体和藻红蛋白 (phycoerythin, PE) 标记的链霉亲和素。首先, 加入已稀释的微球50 μL于96孔板, 洗涤2次并吸去微孔内缓冲液;加入50 μL已稀释的标准品、阴阳性对照和已稀释样本, 室温震荡温育30 min;洗涤3次, 再加入已稀释的检测抗体25 μL, 室温震荡温育30 min;洗涤3次, 再加入50 μL已稀释的PE标记的链霉亲和素, 室温震荡温育10 min;洗涤3次, 再加入125 μL分析缓冲液重悬微球。震荡混匀30 s后上机检测。检测仪器为Bio-Plex 200LUMINEX仪 (美国BIO-RAD公司) 。

三、血常规、血生化、乙型肝炎标志物和HBV DNA载量检测

血常规检测采用日本Sysmex KX-21全自动血液分析仪及配套试剂。血生化检测采用富士700全自动生化分析仪及配套试剂。乙型肝炎标志物5项检测采用德国罗氏Cobas e601全自动电化学发光仪及配套试剂。HBV DNA检测采用美国ABI-7300荧光聚合酶链反应仪, HBV核酸定量检测试剂盒由湖南圣湘生物科技公司提供。

四、统计学方法

所有数据采用SPSS 10.0统计软件处理。正态分布的计量资料以±s表示, 组间数据比较采用方差分析和t检验。非正态分布数据以中位数 (范围) 表示, 采用非参数秩和检验。相关性分析采用Spearman秩相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果
一、各组对象细胞因子水平的比较

ACLF组、CHB组和对照组3组间IL-6、IL-8和TNF-α水平差异有统计学意义(P<0.01),ACLF组>CHB组>对照组;HBV DNA、乙型肝炎表面抗原 (hepatitis B surface antigen, HBsAg) 等病毒学指标在各组间差异无统计学意义。见表2:

表2 ACLF组、CHB组和对照组细胞因子及HBV DNA、HBsAg水平的比较
注:与对照组比较,*P<0.05、**P<0.01;与CHB组比较,#P<0.01.

二、细胞因子和MELD评分在不同临床转归ACLF患者中的比较

死亡组IL-6、TNF-α水平和MELD评分明显高于治愈组(P<0.05) 。见表3:

表3 不同临床转归ACLF患者细胞因子和MELD评分的比较
注:与死亡组比较,*P<0.05.

三、细胞因子与临床指标的相关性分析

由于ACLF组IL-6、IL-8、TNF-α明显升高, 且死亡组IL-6、TNF-α明显高于治愈组, 进一步分析ACLF患者IL-6、IL-8、TNF-α与ALT、AST、凝血酶原活动度 (prothrobin activity, PTA) 、MELD评分等临床指标的相关性。结果显示IL-6、TNF-α与PTA呈明显负相关 (r= －0.521,P=0.009;r= －0.712,P<0.001);TNF-α、IL-6与MELD评分之间呈明显正相关(r=0.491,P=0.015;r=0.379,P=0.048) 。而其他细胞因子与ALT、AST、HBV DNA、HBsAg等指标之间无明显相关性。见图1:

图1 IL-6、TNF-α与PTA、MELD评分之间相关性分析

讨 论

在我国, HBV相关的ACLF是肝衰竭的主要类型, 其发生机制十分复杂, 目前尚未完全明确。有研究表明, 系统性炎症反应综合征 (systemic inflammatory response syndrome, SIRS) 是ACLF的重要病理生理过程之一, 而细胞因子在SIRS的发生、发展过程中起着重要作用[ 2]。ACLF的二次损伤学说也同样强调细胞因子的重要性。二次损伤学说认为:HBV感染后, 机体产生特异性细胞毒性T淋巴细胞 (cytotoxic T lymphocyte, CTL),特异性CTL为清除HBV而攻击感染HBV的肝细胞, 从而造成大量的肝细胞溶解和凋亡, 这称为原发性损伤。原发性肝损伤能引起肠源性内毒素血症, 并激活Kuffer细胞释放多种细胞因子, 进而启动一系列级联反应, 产生大量的细胞因子, 这些细胞因子在介导肝脏损伤的同时还进一步募集大量非特异性炎性细胞于肝脏, 从而对肝脏造成更为严重的二次损伤, 甚至导致肝衰竭[ 6, 7]。

细胞因子是细胞间信号传递分子, 根据其功能可以分为促炎细胞因子 (如IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ) 和抗炎细胞因子 (如IL-4、IL-10)[ 8, 9]。本研究通过对ACLF组、CHB组和对照组细胞因子水平的比较分析, 结果发现IL-6、IL-8和TNF-α水平从对照组到ACLF组呈逐渐升高趋势 (ACLF组>CHB组>对照组),3组间差异有统计学意义(P<0.01);IL-4、IL-10等其他细胞因子在ACLF患者无明显升高。Mao等[ 10]和Zou等[ 11]的研究结果表明, ACLF患者肝内IFN-γ和TNF-α表达较CHB患者明显升高, 而抗炎性细胞因子IL-10却没有相应的升高, 这种促炎和抗炎细胞因子表达失衡可能是ACLF发生的免疫病理机制。然而本研究结果中尽管升高细胞因子的种类不尽相同, 但也同样发现了促炎和抗炎细胞因子表达失衡。这提示IL-6、IL-8和TNF-α等促炎性细胞因子升高与ACLF的发生密切相关, 可能在肝脏损伤等病理过程中起重要作用。

由于IL-6、IL-8、TNF-α等细胞因子可能在ACLF病理生理过程中起重要作用, 故本研究进一步比较了死亡组和治愈组之间的IL-6、IL-8和TNF-α水平。结果显示, 死亡组IL-6和TNF-α水平显著高于治愈组(P<0.05) 。这提示IL-6和TNF-α严重升高时预示着疾病预后不良。在本研究中的ACLF患者均伴有一种或多种并发症, 并且死亡组的并发症数量更多、更严重。这表明促炎细胞因子IL-6和TNF-α与ACLF的并发症之间可能互为因果、相互促进。有研究表明, 血液循环中高浓度的细胞因子也会产生激素样的内分泌效应, 其作用于远离分泌部位的其他组织器官, 从而导致血压升高、肺损伤和脑水肿等并发症的产生[ 10],这可能在一定程度上解释了高浓度细胞因子、并发症和疾病预后不良三者间的关系。

IL-6和TNF-α均是强效的促炎细胞因子。有研究表明, 血清IL-6水平与肝细胞坏死程度相关, 并且可在一定程度上反映急性肝衰竭的严重程度[ 4, 12];TNF-α是造成肝细胞损伤的主要因子, 高水平的TNF-α可以诱导肝细胞凋亡与坏死[ 6]。本研究对ACLF患者血清IL-6、IL-8、TNF-α水平与ALT、AST、PTA和MELD评分的相关性进行分析, 结果显示TNF-α、IL-6与PTA呈明显负相关, TNF-α、IL-6与MELD评分呈明显正相关。MELD评分是用于判断终末期肝病严重程度和生存率的预测指标, PTA也是反应肝脏合成功能和疾病严重程度的指标。这说明IL-6和TNF-α与疾病严重程度和临床转归密切相关, 可能是判断疾病严重程度和临床预后的新指标。

综上所述, HBV相关ACLF患者血清中多种细胞因子明显升高, 其中促炎细胞因子IL-6和TNF-α随疾病严重程度的增加而增加 (ACLF死亡组>ACLF治愈组>CHB组>对照组),且与PTA、MELD评分之间有良好的相关性。这提示细胞因子可能在ACLF发生、发展过程中起着重要的作用, 并且促炎性细胞因子 (如IL-6、TNF-α) 与SIRS之间可能互为因果, 共同促进ACLF的发生。因此, 检测血清细胞因子变化对ACLF患者疾病严重程度和临床转归的判断有重要意义。然而, 本研究仅分析了血清细胞因子的表达变化, 由于血清细胞因子来源复杂, 故只能在一定程度上反映肝脏的细胞因子变化特点。另外, 因研究对象特殊而使ACLF组样本量较小, 故尚需扩大样本量进行观察和研究。

参考文献
[1] Li K, Li NL, Wei D, et al. Activation of chemokine and inflammatory cytokine response in hepatitis C virus-infected hepatocytes depends on Toll-like receptor 3 sensing of hepatitis C virus double-strand ed RNA intermediates[J]. Hepatology, 2012, 55(3): 666-675. [本文引用:1]
[2] 叶一农, 高志良. 乙型肝炎肝衰竭发生机制中的三重打击[J]. 传染病信息, 2009, 22(5): 276-279. [本文引用:2]
[3] Graziadei IW. The clinical challenges of acute on chronic liver failure[J]. Liver Int, 2011, 31(Suppl 3): 24-26. [本文引用:1] [JCR: 3.87]
[4] Martin CM, Welge JA, Shire NJ, et al. Cytokine expression during chronic versus occult hepatitis B virus infection in HIV co-infected individuals[J]. Cytokine, 2009, 47(3): 194-198. [本文引用:2] [JCR: 2.518]
[5] 李子安, 阿祥仁, 顾玉海. 高原地区慢性肺心病患者IL-6、IL-8、IL-17、IL-18含量检测及临床意义[J]. 检验医学, 2012, 27(7): 617-618. [本文引用:1]
[6] Kamath PS, Wiesner RH, Malinchoc M, et al. A model to predict survival in patients with end-stage liver disease[J]. Hepatology, 2001, 33(2): 464-470. [本文引用:3]
[7] González-Reimers E, Sánchez-Pérez MJ, Santolaria-Fernández F, et al. Changes in cytokine levels during admission and mortality in acute alcoholic hepatitis[J]. Alcohol, 2012, 46(5): 433-440. [本文引用:1] [JCR: 2.255]
[8] 梁 伟, 杨 晖, 吴春芳, 等. 不同调脂治疗方案对冠心病患者血脂和IL-6、TNF-α水平的影响[J]. 检验医学, 2011, 26(3): 193-197. [本文引用:1]
[9] Stanley AC, Lacy P. Pathways for cytokine secretion[J]. Physiology（Bethesda), 2010, 25(4): 218-229. [本文引用:1]
[10] Mao WL, Chen Y, Chen YM, et al. Changes of serum cytokine levels in patients with acute on chro-nic liver failure treated by plasma exchange[J]. J Clin Gastroenterol, 2011, 45(6): 551-555. [本文引用:2] [JCR: 3.203]
[11] Zou Z, Li B, Xu D, et al. Imbalanced intrahepatic cytokine expression of interferon-gamma, tumor necrosis factor-alpha, and interleukin-10 in patients with acute-on-chronic liver failure associated with hepatitis B virus infection[J]. J Clin Gastroenterol, 2009, 43(2): 182-190. [本文引用:1] [JCR: 3.203]
[12] 李清明, 舒仁明, 王家驷, 等. 血清白介素-6在诊断肝细胞肝癌中的临床价值研究[J]. 川北医学院学报, 2011, 26(3): 251-253. [本文引用:1]