引用本文
马晓萍, 高晓勤, 杨燕平, 杨喆. 人精子顶体内顶体蛋白酶和透明质酸酶对男性生育力的影响. 29(3): 258-261[MA Xiaoping, GAO Xiaoqin, YANG Yanping, YANG Zhe. The influence of acrosome enzyme and hyaluronidase in human sperm acrosome on male fertility.Labratory Medicine, 29(3): 258-261]  
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人精子顶体内顶体蛋白酶和透明质酸酶对男性生育力的影响
马晓萍1, 高晓勤1, 杨燕平2, 杨喆2
1.遵义医药高等专科学校组织胚胎学教研室,贵州 遵义 563002
2.贵阳医学院组织胚胎学教研室,贵州 贵阳 550004

马晓萍,女,1984年生,硕士,讲师,主要研究方向为男性生殖学、组织学与胚胎学。

高晓勤,联系电话:0852-8925881。

基金:贵州省科学技术基金项目(黔科合J字[2011]2273号);
摘要
目的

探讨人精子顶体内酶对男性生育力的影响。

方法

参照世界卫生组织标准方法对52例不育症患者、12名正常生育者[正常生育组,精子密度为(50~100)×109/L、精子活动率为60%~90%]进行精液常规分析。不育组按精子密度不同分为B1(<20×109/L)、C1(20×109~40×109/L)及D1(>40×109/L)3组;按精子活动率不同分为B2(<30%)、C2(30%~50%)及D2(>50%)3 组]。采用改良明胶底物膜法和改良透明质酸钠-明胶底物膜法分别检测精子顶体内顶体蛋白酶(ACE)活性(ACE阳性反应率、ACE活性强度)和透明质酸酶(HYD)活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)。

结果

精子ACE活性(ACE阳性反应率、ACE活性强度)与精子密度、活动率、形态畸形率明显相关[相关系数(r)分别为0.797、0.867,0.831、0.860和-0.625、-0.546,P均<0.01];精子HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)与精子密度、活动率、形态畸形率明显相关[r值分别为0.832、0.855,0.842、0.830和-0.625、-0.554,P均<0.01]。不育各组精子形态畸形率明显高于正常生育组(P<0.01)。C1组、D1组和C2组、D2组ACE活性(ACE阳性反应率、ACE活性强度)、HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)明显低于正常生育组(P<0.01)。各组酶活性随精子密度及活动率增加而上升。

结论

精子ACE、HYD活性的检测可作为一种有效的判断生育力的检测指标。

关键词: 顶体蛋白酶; 透明质酸酶; 生育力; 男性
中图分类号:Q556 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2014)03-0258-04
The influence of acrosome enzyme and hyaluronidase in human sperm acrosome on male fertility
MA Xiaoping1, GAO Xiaoqin1, YANG Yanping2, YANG Zhe
1.Department of Histology and Embryology, Zunyi Medical and Pharmaceutical College, Guizhou Zunyi 563002, China;
2.Department of Histology and Embryology, Guiyang Medical College, Guizhou Guiyang 550004, China
Abstract
Objective

To investigate the influence of enzymes in human sperm acrosome on male fertility.

Methods

According to the World Health Organization standard method, 52 cases were enrolled as infertile group, and 12 cases were enrolled as normal control group[sperm density (50-100)×109/L and sperm motility 60%-90%], and semen routine analysis was performed. According to the density of sperm, the infertile group was classified into infertile group B1(<20×109/L), C1(20×109 -40×109/L) and D1(>40×109/L), and according to the motility of sperm, the infertile group was classified into infertile group B2(<30%), C2(30%-50%) and D2(>50%). The positive reaction rate and activity intensity of acrosome enzyme (ACE) were detected by fixed gelatin substrate film technique . The positive reaction rate and activity intensity of hyaluronidase (HYD) were detected by modified sodium hyaluronate-gelatin membrane.

Results

There was a significant correlation between the positive reaction rate and activity intensity of ACE with sperm density, sperm motility and sperm deformity rate [correlation coefficients (r) were 0.797, 0.867; 0.831, 0.860 and -0.625, -0.546,P<0.01]. There was a significant correlation between the positive reaction rate and activity intensity of HYD with sperm density, sperm motility and sperm deformity rate (r were 0.832, 0.855; 0.842, 0.830 and -0.625, -0.554,P<0.01). The sperm deformity rate in infertile group was higher than that in normal control group (P<0.01). The positive reaction rates and activity intensities of ACE and HYD in infertile group C1, D1 and C2, D2 were significantly lower than those in normal control group (P<0.01). The activity of enzymes increased with the sperm density and motility.

Conclusions

The detections of sperm ACE and HYD are effective parameters for the analysis of male fertility.

Keyword: Acrosome enzyme; Hyaluronidase; Fertility; Male
引言

常规精液分析一直是评价男性生育力的主要实验室手段,但对全面了解和提示精子使卵子受孕的能力尚显不足。精子形态、密度、活动率是受精过程中重要的参数之一,与顶体内酶系有十分密切的关系[1]。精子是个形态特殊的细胞,头端有一染色致密浓缩的细胞核,前端覆盖有顶体,内含有多种溶酶体酶,其中以顶体蛋白酶(acrosome enzyme,ACE)及透明质酸酶(hyaluronidase,HYD)与受精关系最为密切[2],在精子受精过程中起着非常重要的作用。二者协同检测,可作为判断男性生育能力的指标[3]。已有文献报道运用改良底物膜法检测不育男性精子HYD活性与精液参数的关系[4],但同时对顶体内2种受精关键酶—ACE活性与HYD活性检测与精液参数的关系报道较少。我们应用细胞化学染色技术,利用精子ACE能溶解蛋白质和精子顶体内HYD能溶解卵丘基质的透明质酸的酶学特性,选用改良明胶底物膜法[3]和改良透明质酸钠-明胶底物膜法[5],在光镜下分别观测不育症患者精子ACE活性(ACE阳性反应率、ACE活性强度)和HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度),分析不育症患者精子顶体内HYD、ACE活性与精液常规参数的关系,以探讨其与男性生育力的影响。

材料和方法
一、对象

选择贵阳医学院附属医院生殖检验中心不育症患者52例,年龄24~30岁,均为已婚同居2年以上,性生活正常且排除女方不育原因者。以12名有生育能力的自愿献精者作为正常生育组,年龄24~30岁。

二、主要仪器及试剂

Anke-GL-16 G-Ⅱ型高速冷冻离心机(上海安亭仪器厂),SPX-150C型恒温恒湿箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂),Sartorius BS2103电子天平(北京赛多利斯天平有限公司),伟力WLJY9000彩色精子质量检测系统(北京伟力新世纪科技发展有限公司),Mias摄影图象分析系统(上海天程科技有限公司)。

三、方法

1.标本来源

受试者禁欲3~5 d,用新洁尔灭消毒手及尿道口,以手淫法获取1 次全部精液,放入一次性无菌干燥带盖塑料容器内,置37 ℃恒温水浴箱中,孵育30 min,待完全液化后,以伟力WLJY9000彩色精子质量检测系统对每份标本进行临床精液常规检查及计算机辅助精液分析(CASA),观察精子密度、精子活动率、精子畸形率等指标。

2.分组

依据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)标准将52例不育癌患者按精子密度不同分为B1(>40×109/L)、C1[(20~40)×109/L]及D1(<20×109/L)3组;按精子活动率不同分为B2(>50%)、C2(30%~50%)及D2(<30%)3组。正常生育组精子密度为(50~100)×109/L,精子活动率为60%~90%。

3.标本处理

精液以900× g离心10 min,弃上层精浆,下层沉淀物以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次,并悬浮于2倍以上PBS中,分作双份备用。将上述PBS精子悬浮液1、2 滴分别涂于改良明胶底物膜片[4]和改良透明质酸钠-明胶底物膜片[5]上,置于37 ℃恒温恒湿箱孵育,3 h后取出,室温下干燥,于普通光镜下观察孵育结果。

四、观察指标

1.ACE或HYD阳性反应率

终止孵育后,每份孵育片于Leica DME光学显微镜下均匀选取5~6个视野,随机观察200个精子头部,出现周围晕环者视为ACE或HYD阳性。

2、ACE或HYD活性强度

采用测微尺测量视野下每个精子头部晕环直径的大小,取其平均值作为判断ACE或HYD活性强度的指标。

五、统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计分析。数据以 ±s表示,对于正态分布变量经方差齐性检验。组间比较用LSD法,相关性分析用双变量相关分析。 P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、精子ACE、HYD活性与精子密度、活动率、形态畸形率之间的关系

对全部64份标本的精子ACE、HYD活性与精子密度、活动率、形态畸形率进行相关分析。结果显示精子ACE活性(ACE阳性反应率、ACE活性强度)与精子密度、活率、畸形率呈明显相关[相关系数( r)分别为0.797、0.867,0.831、0.860和-0.625、-0.546, P均<0.01];精子HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)与精子密度、活率、形态畸形率呈明显相关[ r值分别为0.832、0.855,0.842、0.830和-0.625、-0.554, P均<0.01]。

二、正常生育组与不育组精子ACE、HYD活性分析

不育组精子形态畸形率明显高于正常生育组( P<0.01);而ACE活性(ACE阳性反应率、ACE活性强度)及HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)则明显低于正常生育组( P<0.01)。见表1:

表1 正常生育组和不育组精子形态畸形率及精液ACE、HYD活性结果
三、正常生育组与不同精子密度不育组ACE、HYD活性的分析

C1、D1组ACE活性(ACE阳性反应率、ACE活性强度)及HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)明显低于正常生育组( P<0.01),各组酶活性随精子密度增加而上升,见表2:

表2 正常生育组和不同精子密度不育组精子ACE、HYD活性比较
四、正常生育组与不同精子活动率不育组ACE、HYD活性分析

C2、D2组ACE活性(ACE阳性反应率、ACE活性强度)及HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)明显低于正常生育组( P<0.01);各组酶活性随精子活动率增加而上升。见表3:

表3 正常生育组和不同精子活动率不育组精子ACE、HYD活性比较

各组ACE活性(ACE阳性反应率、ACE活性强度)和HYD活性(HYD阳性率、HYD活性强度)见图1~图4:

图1 正常生育组精子ACE阳性反应率及活性强度

注:ACE平均阳性反应率为83.88%,ACE平均反应区直径为45.28 μm (光镜10×100)

图2 正常生育组精子平均HYD阳性反应率及活性强度

注:HYD平均阳性反应率为77.96%,HYD平均反应区直径为48.94 μm (光镜10×100)

图3 不育组精子ACE阳性反应率及活性强度

注:ACE平均阳性反应率为43.89%,ACE平均反应区直径为27.40 μm (光镜10×100)

图4 不育组精子HYD阳性反应率及活性强度

注:HYD平均阳性反应率为38.34%,HYD平均反应区直径为27.37 μm (光镜10×100)

讨论

精子顶体内含有人类已知的24种酶,其中以ACE及HYD与受精关系最为密切[2]。当精子获能时,顶体释放ACE水解卵子透明带,能使精子顺利的通过[6]。HYD是一种重要的精子顶体酶,能使含有透明质酸的卵丘解,卵泡周围的颗粒细胞分散,便于精子通过[7]。在顶体蛋白酶及其他酶系的密切配合下,为精卵融合、形成受精卵创造条件。因此,测定精子ACE、HYD活性是评价精子功能的重要指标。二者协同检测可作为判断男性生育能力的指标[3]。在以往对精子顶体内酶的研究方法中,多数是以生化法检测整份标本中全部精子的ACE活性、HYD活性及顶体反应率。而本研究运用固定明胶底膜法[3]和改良透明质酸钠-明胶底物膜法[5]来分别检测精子顶体内ACE活性、HYD活性,能反映单个精子内ACE、HYD活性的强弱及阳性率的高低,比以往生化检测法更具临床优势及实用性。精子头部亮环直径的大小和亮度的强弱可以反映出精子所含ACE、HYD量的多少和酶活性的高低;而酶活性阳性反应率的高低则反映了精子有受精能力百分比的高低。本研究结果表明精子ACE活性(ACE阳性反应率、ACE活性强度)及HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)与精子密度、活动率和畸形率呈明显相关。不育组精子ACE活性(ACE阳性反应率、ACE活性强度)及HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)随精子密度及活动率减低而下降,并随精子畸形率的升高而下降。正常生育组精子ACE、HYD阳性反应率及活性强度等指标均优于不育组。精子顶体内酶的活性首先依赖于顶体的完整状态[8]。畸形及活力差的精子其顶体也常为畸形,引起顶体内酶系流失,导致不育。

综上所述,精子ACE、HYD活性可作为一种有效的判断生育力的指标。在进行精液常规检验的基础上,再进行精子顶体内酶活性的观察,有利于提高临床男性不育的诊断水平。本研究采用的检测方法操作简便易行,结果准确可靠,可以测定单个精子顶体内ACE、HYD活性。在以往对精子顶体内酶的研究方法上再结合本研究方法共同分析精子顶体内酶对生育力的影响,可为男性不育症的诊断、治疗及病情观察提供重要理论依据。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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