选取上海市肺科医院2012年3月2013年2月的疑似结核病初诊患者,疑似患者主要根据临床症状、体征及胸部X线或者CT表现。所有患者进行痰涂片、培养和荧光定量PCR检测结核菌。最终有206例临床确诊为肺结核病例作为我们的研究对象,其确诊标准为同时满足以下3个条件:(1)有临床症状、体征和X线或者CT表现;(2)痰培养阳性并鉴定为结核分枝杆菌;(3)临床抗结核治疗有效。另有103例确诊为非结核患者,主要为细菌性肺炎、支气管扩张症以及慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者。

4% NaOH本实验室自行配制。染色液:金胺“0”1 g溶于95% 乙醇100 mL中,加5% 石炭酸液900 mL混匀即可。脱色剂:3%盐酸酒精。复染剂:高锰酸钾0.5 g,溶于100 mL蒸馏水。结核分枝杆菌荧光定量PCR试剂盒由凯杰生物公司提供。仪器为ROCHE LightCycler 480荧光定量PCR仪(Roche公司)。MGIT 960结核菌液体快速培养系统(美国BD公司)。

收集痰标本之前,患者需刷牙、漱口,并深咳后留痰。患者常规留取3次痰涂片。痰培养的痰液量为25 mL。荧光定量PCR留取的痰液量为510 mL(留取时间为24 h之内,累积收集),采用50 mL的尖底无菌离心管收集痰标本。

每个标本同时按标准(2 cm×1 cm)涂2张大小、厚度相当的片子待干,火焰固定,染色、荧光显微镜下镜检。染色方法:将痰液涂片用荧光染色液染10 min,水洗后用3% 的盐酸酒精脱色1~2 min,至外观无黄色为止,水洗后加复染剂1~2 min,水洗,晾干。

痰液以23倍体积4% NaOH液化15 min后,3 000× g,离心15 min,小心弃上清,留取底部沉淀;加入45 mL生理盐水,震荡混匀后,3 000× g,离心15 min,小心弃上清,留取底部沉淀;同样方法,再次洗涤1遍。最后加入1 mL生理盐水,重悬沉淀,取0.5 mL用于(美国BD公司MGIT 960)液体快速培养。所有培养阳性均经过菌种鉴定,确认为人结核分枝杆菌。

1.痰标本消化处理

根据痰液黏稠度加入23倍体积的4% NaOH,充分震荡混匀后,室温放置1520 min,待痰液充分液化后,混匀,吸取1.0 mL至1.5 mL的离心管中,用于按照试剂盒说明书进行的DNA抽提。剩余的痰标本用于改进的超声破碎DNA抽提步骤。

2.试剂盒的DNA抽提步骤(常规法)

液化好的痰液置于4 ℃低温离心机中,5 000× g,离心5 min,小心弃上清,留取底部沉淀;加入1 mL生理盐水,震荡混匀后,5 000× g,离心5 min,小心弃上清,留取底部沉淀;再加入1 mL生理盐水, 5 000× g,离心5 min,弃上清;加入试剂盒提供的40 μL DNA抽提液,充分震荡混匀;100 ℃干浴10 min;12 000× g离心10 min后,取上清2 μL用于荧光定量PCR检测。

3.改进超声破碎法DNA抽提步骤(增量超声法)

液化好的痰液置于4 ℃低温离心机中,3 000× g,离心15 min,小心弃上清,留取底部沉淀;加入45 mL生理盐水,震荡混匀后,3 000× g,离心15 min,小心弃上清,留取底部沉淀;加入1 mL生理盐水,转入1.5 mL的离心管中,5 000× g,离心5 min,弃上清;加入试剂盒提供的40 μL DNA抽提液,充分震荡混匀;100 ℃干浴10 min;待标本降至室温后,放入水浴超声破碎仪中,300 W功率,超声破碎15 min。12 000× g离心10 min后和常规提取的DNA标本同时进行荧光定量PCR检测。

分别统计2种不同的处理方法对于结核诊断的敏感性、特异性。采用卡方检验比较2组方法的差异性。将定量结果转换为以2为底的对数值,采用配对 T检验比较2种方法定量结果之间的差异,并用线性回归方法对两者之间的结果进行回归和相关分析。所有统计采用SPSS 17.0软件进行计算处理。

目前我国结核病的诊断的实验室检查还是依赖于传统的细菌涂片和培养。2000年以来,在一些有条件的医院逐渐开展结核菌的快速培养和基因检测^[6,7,8]。一般来说抗酸染色涂片检测结核菌的敏感性在104105 cfu/mL,浓缩涂片的敏感性可以达到102 cfu/mL^[9]。液体培养的敏感性在10100 cfu/mL。分子生物学的检测敏感性可以达到10 cfu/mL^[10],也就是说分子诊断的灵敏度和液体培养接近。由于分子诊断具有较高的敏感性和特异性,因此,出现了各种各样的结核基因诊断检测方法,如荧光定量PCR检测结核DNA、等温扩增检测结核RNA等。本研究采用国产的荧光定量PCR试剂,采用常规方法,对肺结核的诊断敏感性为73.8%,这个结果和国内一些结核病实验室的研究报道类似^[4]。采用改进的增量超声破碎法处理标本后,对于肺结核的诊断敏感性提高到了89.8%,基本接近于国际先进的Gene Xpert^® MTB/RIF等产品报道的结果^[1,3]。当然,这需要进一步的对比研究才能得出确切的数据。本研究结果表明,增量超声法CT值较常规方法平均减少3.786,也就是相当于增加14倍的DNA浓度。因此,改进的标本处理方法显著的提高了诊断的敏感性和定量数值。

分子诊断虽然具有较高的敏感性,但是由于是手工操作,存在交叉污染的可能性,因此其特异性也是一个非常值得关注的问题,本研究结果表明增量超声破碎法并没有因为增加了痰液量和超声破碎的步骤,而导致诊断的特异性下降。

在本研究中,常规方法使用的痰液量仅为0.30.5 mL左右,而增量超声法的痰液量在510 mL,相当于前者的10300倍;也就是相当于有10300倍的结核菌被用于核酸抽提,充足的结核菌是提高肺结核诊断敏感性的主要原因。另外,常规方法主要采用裂解液和煮沸来破坏结核菌菌体,达到释放结核菌DNA的效果。而本研究除了采用裂解液裂解和煮沸之外,还增加了国际上公认的最有效的超声破碎法来进一步提高菌体裂解效果。在实际工作中发现痰液在采用氢氧化钠液化后,经常会有一些较大、硬的沉淀物残留。为了保证充分的裂解效果,本研究采用了大功率(300 W)超声破碎仪,并作用较长的时间(15 min)。大功率、长时间的超声破碎能够充分的释放菌体中的DNA,因而也是诊断敏感性和定量结果提高的另一个重要原因。

国际上有很多提高结核分子诊断敏感性的手段,如采用超声破碎提取结核菌,采用磁珠纯化结核菌DNA,以及采用巢氏PCR来提高PCR检测的灵敏度。采用磁珠纯化等方法纯化DNA是一条必然要走的道路,因为痰液直接裂解物中会存在一些杂质,抑制PCR的反应^[5]。国际先进的Gene Xpert^®MTB/RIF产品就是采用磁珠纯化DNA方法来抽提痰液中结核菌的DNA,在手工操作时由于增加了DNA纯化的步骤,无疑增加了试剂成本和检测产物交叉污染的可能性。巢氏PCR虽然能提高诊断的敏感性,但是采用手工操作时,交叉污染的危险大增,可能会导致较高的假阳性。因此,我们认为其只适合于自动化的仪器操作检测系统,如Gene Xpert^® MTB/RIF产品。本研究结果表明,通过增加痰液量和超声破碎提取核酸法,可以明显的提高结核菌的检出敏感性和定量结果。这个方法在几乎没有增加检测成本的情况下,达到了较好的检测效果,在经济条件有限的国家和地区值得进一步推广。