1.病例 患儿, 女, 14岁。诊断全身型幼年特发性关节炎(systemic juvenile idiopathic arthritis, SOJIA) 3月余, 发现两系下降2 d于2014年4月第2次入院, 曾因“ 反复发热2月余” 于2013年11月第1次入院。当时诊断为SOJIA, 经治疗好转后出院。第2次入院前, 甲泼尼龙减量至12 mg/d, 环孢素100 mg/d。入院前2 d门诊随访查血常规显示白细胞(white blood cell, WBC )1.9× 10⁹/L, 血小板(platelet, PLT) 36× 10⁹/L (两系降低), 无发热、皮疹、咳嗽、咳痰、关节肿痛等症状。入院后患儿WBC进一步下降至0.8× 10⁹/L, 考虑原发病活动, 给予甲强龙20 mg+甲泼尼龙16 mg/d+环孢素100 mg/d治疗原发病, 氟康唑抗感染, 丙球蛋白对症支持。2014年4月7日因两系下降进行血培养检查。2014年4月21日经16S rRNA 基因序列测定提示为嗜冷杆菌属生长。

2.仪器与试剂 BACT/Alert 3D全自动血培养仪、Vitek 2 Compact全自动微生物分析仪购自法国生物梅里埃公司; MicroScan微生物鉴定仪购自美国西门子公司; 聚合酶链反应(polymerase chain reaction , PCR)扩增仪购自新加坡公司; 基因组提取试剂盒购自北京天根生化公司; PCR反应试剂盒、DNA标准带购自日本Takara公司; 基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)分析仪购自德国Bruker Daltonik公司。

3.标本接种与全自动微生物分析仪鉴定 血培养提示阳性后, 转种于血平板、巧克力平板及麦康凯平板, 置35 ℃含5%CO₂孵箱培养。每天观察菌落生长状况, 待有生长时对菌落进行革兰染色、氧化酶试验、触酶试验以及其他生化反应。分别采用Vitek 2 Compact全自动微生物分析仪和MicroScan微生物鉴定仪对细菌进行鉴定。

4.细菌DNA提取及16S rRNA 基因序列测定 采用天根生化试剂盒提取细菌DNA, 提取的DNA作为模板待用。采用16S rRNA 基因序列测定法进行分子鉴定。参考引物序列如下:16S rRNA上游引物5'-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3', 16SrRNA下游引物5'-GGT-TACCTTGTTACGAC-TT-3'。PCR扩增反应体系为:10× Buffer缓冲液2.5 μ L; dNTPMix 2 μ L; TaqDNA聚合酶0.5 μ L; DNA模板1 μ L; 上、下游引物各1 μ L; ddH₂O 17 μ L。PCR扩增条件为:94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 57 ℃ 30 s, 72 ℃ 90 s, 32个循环; 72 ℃ 10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳, 紫外灯下观察结果。将PCR产物送铂尚生物技术(上海)有限公司测序, 所得序列在NCBI进行比对。

5.质谱仪鉴定 MALDI-TOF MS是可用于微生物鉴定的一种新的强有力的技术^[3], 我们对这株可疑菌株进行质谱检测。将纯分培养48 h的菌株送到上海交通大学附属新华医院, 同时采用直接法和裂解法进行质谱鉴定。

1. 形态学 该菌在血平板和巧克力平板上均可生长, 麦康凯平板上不生长。水解酪蛋白胨平板生长不良, 需培养3~5 d。4 ℃生长缓慢。35 ℃培养24 h后血平板上可见针尖大小的菌落; 培养36~48 h后, 可见直径约为1~2 mm、圆形、湿润、光滑、不透明、边缘整齐的菌落, 不溶血, 经革兰染色, 油镜下可见革兰阴性球杆菌, 成双排列。

2.生化反应 该菌氧化酶、触酶试验阳性, 还原硝酸盐, 不分解葡萄糖、木糖、甘露醇、麦芽糖、乳糖/蔗糖, 产酸, 吲哚阴性。Vitek 2 Compact全自动微生物分析仪不能鉴定。MicroScan微生物鉴定仪鉴定结果显示, 嗜冷杆菌亚种的概率为28.59%, 概率太低, 结果不可靠。

3.16S rRNA 基因序列测定法鉴定 经过在GenBank上进行BLAST比对, 比对结果为嗜冷杆菌属亚种(Psychrobacter sanguinis)。

4. 质谱检测 裂解法结果第1位为巴氏发菌属亚种(Balneatrix alpica CIP 103589T HAM), Score Value为1.357, 嗜冷杆菌属细菌(Psychrobacter lutiphocae UGV 4123 UGV)位列第2位。直接菌落法结果第1位为莫拉克斯菌属亚种(Moraxella_sg_Branhamella catarrhalis 322 MLD), Score Value为1.357, 相应的嗜冷杆菌属细菌(Psychrobacter lutiphocae UGV 4123 UGV)只列第6位。但质谱结果的判读, Score Value至少在1.7以上可信, 所以本次质谱仪鉴定结果可信度不高。

关于嗜冷杆菌属细菌感染人类的病例较少见。Lloyd-Puryear等^[4]1991年从一位2岁幼儿脑脊髓液中分离到1株不动嗜冷杆菌(Psychrobacter immobilis); Wirth等^[5]在2012年报道3例血行感染, 3例患者均是年老患者。本病例中患者是儿童, 因为自身免疫性疾病需要长期服用免疫抑制剂, 免疫力低下感染了嗜冷杆菌。血培养指证中指出血液病患者粒细胞减少、PLT少, 应做血培养。但对于长期使用免疫抑制剂的患者, 免疫力低下, 血象改变时, 也应该考虑常规进行血培养检测。而且检验科医师不能仅仅只对标本检测, 出现疑难菌株时, 应该及时与临床沟通, 了解临床症状, 更快、更准确地鉴定细菌。

目前对于菌株的鉴定, 临床微生物科室主要是用以生化反应为原理的全自动微生物分析仪进行鉴定, 该系统有高度的特异性、敏感性和重复性, 还具有操作简便等特点, 绝大多数细菌的鉴定在2~18 h内能得出结果。但对于疑难菌株, 全自动分析仪中的生化反应分辨率不高, 甚至出现错误报告, 这给检验科带来困扰。分子生物学方法16S rRNA 基因序列法可以快速、准确地对微生物进行分类鉴定, 确定微生物在进化中的位置, 已成为微生物分类学中最重要的方法^[6]。随着蛋白质组学和质谱仪的发展, 拥有强大细菌库的质谱仪应运而生, 这种蛋白组学鉴定方法适合对生物活性物质的快速、大规模、高通量筛选, 已经成为临床诊断、环境监测和微生物分类研究或食品加工质量控制中的重要方法。该技术的优点是待测组分中的杂质(如较高浓度的盐、非挥发性成分以及去垢剂)不影响目标物质的测定, 且信息直观、操作简单、快速准确^[7]。不过对于本菌, 质谱仪因为没有相应的细菌库, 所以鉴定不准确。而有“ 细菌活化石” 之称的16S rRNA 基因序列法却鉴定出了该细菌为Psychrobacter sanguinis。质谱仪以其高速准确的特点, 能否代替现在普遍开展的全自动微生物分析仪成为常规方法, 还有待更多的数据去证实。