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黄宏耀, 钱进, 王能, 邓涛, 彭家群, 张振建. 独立生长因子1与隐匿性乙型肝炎病毒感染的相关性研究. 29(12): 1270-1271
  
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独立生长因子1与隐匿性乙型肝炎病毒感染的相关性研究
黄宏耀, 钱进, 王能, 邓涛, 彭家群, 张振建
随州市中心医院检验科,湖北 随州 441300

通讯作者：张振建,联系电话：0722-3252126。

作者简介：黄宏耀,男,1973年生,硕士,副主任技师,主要从事临床化学及分子生物学研究。

摘要
关键词: 独立生长因子1; 乙型肝炎病毒; 感染
中图分类号:R446.62 文献标志码:B 文章编号:1673-8640(2014)12-1270-02

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是导致肝硬化和肝细胞癌的主要原因, 好发于中青年, 位居全球致死疾病前10位, HBV感染的防控是一个全球性重大的公共卫生问题, 而隐匿性HBV感染(occult hepatitis B virus infection, OBI)的防控更难。2008年欧洲肝脏研究协会定义OBI为肝脏中可检出 HBV DNA而其血清乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen , HBsAg)为阴性的一种特殊的感染状态, OBI患者乙型肝炎核心抗体(hepatitis B core antibody , HBcAb)多为阳性[1]。有研究表明, 独立生长因子1(growth factor independence 1, Gfi-1)是一种锌指阻遏子, 主要表达于T细胞、单核细胞、粒细胞及神经系统, 与白血病、T细胞淋巴瘤等多种免疫疾病明显相关, 本研究拟通过检测OBI患者血清HBV标志物, 并联合检测外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)Gfi-1蛋白及基因表达水平研究二者相关性, 探讨Gfi-1能否作为OBI的辅助诊断指标。

一、材料和方法

1.病例选择 选取2010年1月至2013年6月随州市中心医院住院的HBsAg阳性且HBV DNA定量> 103拷贝/mL的患者50例(对照组), 男26例, 女24例, 年龄(35.7± 16.9)岁; 同期HBsAg阴性、HBcAb阳性且HBV DNA定量< 103拷贝/mL的患者100例(观察组), 男61例, 女39例, 年龄(33.5± 15.3)岁。所有入选患者均未使用糖皮质激素、免疫抑制剂, 不合并肿瘤疾病。另选取体检中心HBsAg阴性、HBV DNA定量为阴性的健康志愿者50名(正常组), 男29名, 女21名, 年龄(36.4± 15.2)岁。3组受试者年龄、性别差异均无统计学意义, 具有可比性。

2.检测指标及检测方法 (1) PBMC的收集:采用葡蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法, PBMC包括单核细胞和T、B淋巴细胞。简要步骤如下:采集受试者静脉血4 mL, 加入4 mL磷酸盐缓冲液混匀; 吸取Ficoll-Hypaque淋巴细胞分层液8 mL加入离心管中, 再将稀释的抗凝血液加至分层液上, 室温600× g离心20 min, 管内液体可分为4层, 最上层为血浆, 最下层为红细胞, 其上有薄薄的一层为粒细胞, 中间为淋巴细胞分离液, 在血浆与分离液之间有一层白色云雾状狭带即为单个核细胞; (2) PBMC mRNA表达检测:用Trizol试剂提取PBMC总RNA, 取1 μ g RNA逆转录合成cDNA, 进行实时定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)。引物由上海英骏生物技术有限公司合成, 内参照物选β -actin, Gif-1上、下游引物序列分别为5'-CAGCCT-GCACCTGTA-CCGATC-3', 5'-TCGAGTCTCTGAAC-CTGCTA-3', 产物为286 bp; 以△ △ Ct方法计算基因相对表达量; (3) PBMC Gfi-1蛋白水平表达:使用Western blot法提取细胞总蛋白, 电泳、转膜、封闭, 加兔Gif-1一抗, 滴加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗, 化学发光分析技术(chemiluminescence analysis , ECL)显影, 胶片曝光, 凝胶成像系统分析; (4)检测受试者的血清HBV标记物(酶联免疫吸附试验)及HBV DNA定量(实时荧光定量PCR)。

3.统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行统计分析, 计量资料用 x-± s表示, 组间比较采用方差分析, 两变量的相关关系采用直线相关分析, 以P< 0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.3组受试者PBMC Gif-1 mRNA及蛋白的表达比较 正常组PBMC有Gif-1 mRNA及蛋白表达, 对照组患者其表达水平明显上调(P< 0.05)。观察组患者PBMC Gif-1 mRNA及蛋白均表达上调(P< 0.05), 但上调水平较对照组患者低(P< 0.05), 见表1、图1。

表1 3组受试者PBMC Gif-1 mRNA及蛋白的相对表达水平( x-± s)

图1 3组受试者PBMC Gif-1蛋白表达(Western blot法)

2. 所有受试者PBMC Gif-1蛋白表达与患者HBV DNA定量的相关性 所有受试者均检测HBV DNA水平, 正常组HBV DNA水平大多在50 拷贝/mL以下, 其对数值在0.0~1.5之间。对照组显性HBV感染患者HBV DNA对数值在3.0~7.0之间, 而观察组OBI患者HBV DNA水平多< 103拷贝/mL, 其对数值在1.5~3.0之间。直线相关分析显示, 所有受试者HBV DNA对数值与其PBMC Gif-1蛋白的相对表达量呈正相关(r=0.791, P< 0.001)。见图2。

图2 受试者HBV DNA定量的对数值与其PBMC Gif-1蛋白表达水平的相关关系

三、讨论

随着分子生物学技术在病毒检测中的应用, 近年来发现部分复制水平较低的HBV携带者血清中检测不到HBsAg, 部分HBsAg阴转的患者血清中仍可检测出低水平HBV DNA或肝组织中检测出HBsAg或HBcAg, 这种情况被称为OBI, 其与临床献血、输血、器官移植等密切相关, 成为较复杂的流行病学和临床问题。Sagnelli等[2]通过多中心临床观察发现, 89例丙型肝炎患者经血清、PBMC及肝脏穿刺等检查, 发现有37例患者合并OBI。因肝脏活检有创伤性, 因此寻找更加方便且有效的OBI检测指标对临床疾病防治有着重要的意义。

OBI与多种因素有关, 如HBV复制水平低、病毒变异、HBV感染PBMC、机体免疫应答异常、合并丙型肝炎病毒感染, 其中最主要的是HBV感染PBMC及机体免疫应答异常, gfi-1基因定位于人染色体1P22, 是一种T淋巴细胞特异的转录因子, 与机体的免疫应答密切相关[3]。因此本研究探讨了OBI患者PBMC gfi-1基因及蛋白的表达, 结果发现OBI患者PBMC gif-1基因及蛋白表达水平均上调, 相关分析显示患者外周血HBV DNA检测量与PBMC Gif-1蛋白水平呈正相关。由此可推测外周血PBMC Gif-1蛋白表达可以作为OBI的辅助检测指标。同时需要进一步肝脏穿刺样本的HBV DNA检查与PBMC Gif-1蛋白表达的相关性研究, 以及需要深入探讨HBV感染引起外周血Gif-1表达上调的可能机制。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Ocana S, Casas ML, Buhigas I, et al. Diagnostic strategy for occult hepatitis B virus infection[J]. World J Gastroenterol, 2011, 17(12): 1553-1557. [本文引用:1]
[2] Sagnelli E, Imparato M, Coppola N, et al. Diagnosis and clinical impact of occult hepatitis B infection in patients with biopsy proven chronic hepatitis C: a multicenter study[J]. J Med Virol, 2008, 80(9): 1547-1553. [本文引用:1] [JCR: 2.373]
[3] Chiang C, Ayyanathan K. Snail/Gfi-1 (SNAG) family zinc finger proteins in transcription regulation, chromatin dynamics, cell signaling, development, and disease[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2013, 24(2): 123-131. [本文引用:1]