1.样本制备 用5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA), 磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)作为空白分析样本(GPI=0.0 mg/L)。以空白样本为基质, 按照不同比例添加高浓度GPI标准抗原, 配制成0.00、0.05、0.10、0.15、0.25 mg/L共5组待测样本。GPI ELISA试剂盒以及标准品均由上海北加生化试剂有限公司提供。

2.方法 空白样本连续检测20次, 各待测样本连续检测11 d(22次)。每次检测的同时做标准品检测。计算空白样本连续20次A值的均值( A-0)、标准差(s₀)。以A值为源数据, 计算各待测样本单次吸光度值(A_n)与 A-0的差值(A_n- A-0), 并求均值( A-An-A-0)、标准差( sAn-A-0)及变异系数(C VAn-A-0)。以浓度值为源数据, 将标准浓度和相应的A值绘制成标准曲线(r≥ 0.995)求得相关公式, 再以各待测样本的A_n值代入公式, 使用Excel软件计算出相应待测样本的浓度值(C_n), 并求得C_n的均值( x- Cn)、标准差( sCn)及变异系数(C VCn)。观察并确认空白样本组及各待测样本组的A值、浓度值均呈正态分布。参照文献[1]的分析灵敏度公式进行评估, 以A值为源数据计算检测低限(lower limit of detection, LLD)= A-0+3× s₀、生物检测限(biologic limit of detection, BLD)= A-An-A-0-3× sAn-A-0≥ LLD, 功能灵敏度(functional sensitivity, FS)=C VAn-A-0≤ 20%。以浓度值为源数据时, LLD= x-C0+3× sC0、BLD= x-Cn-3× sCn≥ LLD, FS=C VCn≤ 20%。本研究估算LLD及BLD取99.7%可能性。

空白样本 A-0为0.068、s₀为0.008 8、CV₀为12.92%、3× s₀为0.026 3, 采用A值为源数据计算得LLD为0.094 3(相应浓度为0.028 mg/L), BLD及FS时为0.15 mg/L。以浓度值为源数据计算得LLD为0.022 3 mg/L, BLD及FS则为0.10 mg/L。使用不同的源数据计算所得出BLD及FS有差异。见表1、表2。

表1

表1

表1 不同浓度样本天间22次检测的A值(扣除空白A值)的均值、标准差及CV 样本(mg/L) C(%) +3× BLD 0.05 0.047 0.016 7 35.57 0.096 9 -0.003 1 0.10 0.066 0.014 1 21.41 0.108 3 0.023 6 0.15 0.089 0.014 9 16.78 0.133 2 0.044 0 0.25 0.120 0.018 8 15.70 0.175 9 0.063 3

表1 不同浓度样本天间22次检测的A值(扣除空白A值)的均值、标准差及CV

表2

表2

表2 不同浓度样本组天间22次检测的最终浓度均值、标准差及CV 样本(mg/L) sC CVC(%) LLD BLD 0.00 -0.016 0.012 7 -80.20 0.022 3 -0.053 9 0.05 0.090 0.027 9 32.69 0.169 0 0.001 7 0.10 0.130 0.021 6 17.19 0.190 9 0.061 0 0.15 0.170 0.023 7 13.67 0.244 2 0.102 2 0.25 0.240 0.031 4 13.22 0.331 5 0.143 2

表2 不同浓度样本组天间22次检测的最终浓度均值、标准差及CV

通常定量方法的分析灵敏度评估主要是以BLD及FS表达。BLD的定义为某样本单次检测可能具有的最小响应量刚大于空白检测低限响应量, 该样本含有的分析物浓度或其它量值为生物检测低限。FS是以天间重复CV为20%时对应检测限样本具有的平均浓度, 确定为检测系统或方法可定量报告分析物的最低浓度或其他量值的限值^[1]。由定义分析BLD及FS均是以检测浓度或其它量值(如A值)表达。参照国内外相关文献介绍的分析灵敏度(包含ELISA)计算使用的源数据基本是初始A值而非最终检测浓度, 然后以A值得到的结果换算成相对应的浓度值。本研究使用2种数据源(初始A值、最终检测浓度值)进行估算, 比对结果显示LLD、BLD及FS的估算结果均有不同程度的差异, 尤以BLD及FS估算结果差异明显(2种源数据计算结果分别为0.15、0.10 mg/L), 采用浓度值为源数据得到的BLD及FS明显优于以A值为源数据计算的结果(暂称为“ 正结果” )。

由于本研究只使用了一种ELISA, 因此这一结果仅说明了采用不同源数据计算得到的分析灵敏度可能存在差异。这种差异可能是由原始数据通过标准曲线计算公式换算成最终报告浓度值时所引进的影响因素(误差或校正)。不同的试剂及实验条件得到的结果可能是正的或负的, 也可能相同。重要的是定量方法的检测结果最终是以浓度值表达, 临床实验室评估分析灵敏度的目的不仅是单纯的评估试剂盒分析性能, 更主要是“ 确定检测系统的可报告低限” 这一重要的分析性能。

本研究认为在确定检测系统可定量报告低限(即分析灵敏度)时以浓度值直接进行计算更为合适。得到的分析灵敏度包含了由原始数据通过标准曲线公式换算为最终报告数据时引进的误差或校正因素, 能更好地、更实际地满足或帮助实验室确定检测系统的可报告低限。另外使用最终浓度值计算分析灵敏度, 可避免使用“ 空白样本” 。被评估项目要取得“ 具有和检验的患者样本相同的基质” 的空白浓度样本非常困难甚至是不可能的, 诸如“ 患者愈合样本” 也只能是目前检测方法尚无法检测, 不是真正意义的“ 空白样本” 。而校正品的“ 零浓度” 样本存在不同程度的“ 基质效应” 。使用原始数据(如A值)进行计算时, 一方面忽略了定量检测实验中标准曲线对报告结果的影响作用, 使实验室得到一个可能不实际的检测系统可报告低限。在实际评估过程中无法避免寻找真正意义的“ 空白样本” 的困惑, 同样也不能消除“ 空白样本” 对分析灵敏度评估工作的干扰。