引用本文
董德平, 顾飞飞, 陈旭, 肖淑珍, 韩立中, 倪语星. 江苏海安地区分离的金黄色葡萄球菌的分子特征及其耐药性分析. 29(12): 1234-1237
DONG Deping, GU Feifei, CHEN Xu, XIAO Shuzhen, HAN Lizhong, NI Yuxing. Analysis on the molecular characteristics and drug resistance of Staphylococcus aureus isolated from Haian,Jiangsu . Labratory Medicine, 29(12): 1234-1237  
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江苏海安地区分离的金黄色葡萄球菌的分子特征及其耐药性分析
董德平1, 顾飞飞2, 陈旭2, 肖淑珍2, 韩立中2, 倪语星2
1.南通大学附属海安医院,江苏 海安 226600
2. 上海交通大学医学院附属瑞金医院,上海 200025

通讯作者：韩立中,联系电话：021-64370045-600632。

作者简介：董德平,男,1968年生,学士,副主任技师,主要从事临床微生物检验工作。

基金:国家自然科学基金资助项目（81472010）; 上海市科学技术委员会科研计划项目（14140900602）; 卫生公益性行业科研专项（201002021）
摘要
目的

分析江苏海安地区分离的金黄色葡萄球菌的分子生物学特征及其耐药性。

方法

收集2011年7月至2012年7月江苏海安地区分离的金黄色葡萄球菌43株,采用生化表型及血浆凝固酶试验鉴定菌株,纸片扩散法和肉汤稀释法检测菌株对12种抗菌药物的敏感性,聚合酶链反应(PCR)检测PV杀白细胞素 (PVL) 基因,采用多重PCR进行葡萄球菌染色体 mec基因盒(SCC mec)分型,运用PCR及序列分析进行金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA) 基因分型。

结果

43株金黄色葡萄球菌中有21株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),t030-Ⅲ为主要流行克隆,该克隆有2个主要的耐药谱型,即P-CX-CN-TOB-E-CC-RA和P-CX-CN-TOB-RA。

结论

江苏海安地区MRSA分离率较高,克隆流行特点明显。

关键词: 金黄色葡萄球菌; 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌; 分子生物学特征; 耐药性
中图分类号:R378.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2014)12-1234-04
Analysis on the molecular characteristics and drug resistance of Staphylococcus aureus isolated from Haian,Jiangsu
DONG Deping1, GU Feifei2, CHEN Xu2, XIAO Shuzhen2, HAN Lizhong2, NI Yuxing2
1. Haian Hospital, Nantong University, Jiangsu Haian 226600, China
2. Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China
Abstract
Objective

To analyze the molecular characteristics and drug resistance of Staphylococcus aureus isolated from Haian, Jiangsu.

Methods

A total of 43 isolates of Staphylococcus aureus were collected in Haian from July 2011 to July 2012, and the isolates were identified by biochemical phenotypic test and plasma coagulase test. Antimicrobial susceptibility test to 12 kinds of antibiotics was performed by disk diffusion and broth dilution methods. Panton-Valentine leukocidin (PVL) gene was detected by polymerase chain reaction (PCR), Staphylococcal cassette chromosome mec (SCC mec) typing was conducted according to multiplex PCR, and Staphylococcus protein A (SPA) genotyping was performed by PCR and sequencing.

Results

A total of 21 isolates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) were detected. t030-Ⅲ was the major MRSA clone, including 2 resistant profiles, P-CX-CN-TOB-E-CC-RA and P-CX-CN-TOB-RA.

Conclusions

The isolation rate of MRSA is high, and clone spread is the main reason of resistance prevalence.

Keyword: Staphylococcus aureus; Methicillin-resistantStaphylococcus aureus; Molecular biological characteristic; Drug resistance

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是医院和社区感染常见的病原菌之一, 在医院环境, 金黄色葡萄球菌可引起血流感染、伤口感染、肺炎等[1, 2]; 而在社区, 金黄色葡萄球菌通常引起皮肤和软组织感染, 如疖、痈、脓肿等[3], 也可引起更加严重的感染, 如坏死性肺炎、脑膜炎、骨髓炎等, 甚至引起死亡[4]。自20世纪60年代在欧美首先发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)以来, MRSA在临床的检出率逐年增高, 耐药性不断增强, 对临床治疗提出严峻挑战。南通大学附属海安医院为海安地区最大的综合性医院, 该院常规进行病原菌的分离培养和药物敏感性试验, 但对菌株的分子流行病学特征和药物敏感性数据缺乏分析和研究。本研究首次对该院分离的金黄色葡萄球菌的分子流行病学特征及其耐药性进行分析。

材料和方法
一、菌株来源

2011年7月至2012年7月南通大学附属海安医院共分离到金黄色葡萄球菌43株, 标本分布为痰液20株、血液8株、脑脊液2株、尿液1株、脓液12株。43株菌株来源于43例患者, 其中1例为门诊患者, 其余42例为住院患者。

二、方法

1.鉴定方法 对菌落特征疑似金黄色葡萄球菌(灰白或金黄色, β 溶血)、触酶试验阳性的细菌进行分离纯化, 进行下列鉴定试验:镜下形态(革兰染色阳性球菌, 呈葡萄堆状)、鸟氨酸脱羧酶试验、DNA酶试验、高盐甘露醇平板生长试验、胶乳凝集试验及血浆凝固酶试验(试管法)等[5]。

2.体外药物敏感性试验 鉴定为金黄色葡萄球菌的菌株采用纸片扩散法和肉汤稀释法进行体外药物敏感性试验, 细菌药物敏感性试验操作和判读参照美国临床实验室标准化协会 (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI) 2013版指南。测试药物包括:青霉素(10 U)、头孢西丁(30 μ g)、庆大霉素(10 μ g)、妥布霉素(10 μ g)、红霉素(15 μ g)、替考拉宁(30 μ g)、米诺环素(30 μ g)、克林霉素(2 μ g)、复方磺胺甲口恶唑(25 μ g)、利福平(5 μ g)、利奈唑胺(30 μ g)、夫西地酸(10 μ g)和莫匹罗星(5 μ g), 药物敏感性试验药物纸片均由Oxoid(英国)公司生产; 西门子公司MicrosanautoSCAN4的MicrosanautoPC33板条检测万古霉素的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC); 根据头孢西丁的药物敏感性结果区分甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-susceptible Staphylococcus aureus, MSSA)和MRSA[6]。

3. 葡萄球菌染色体mec 基因盒(Staphylococcal cassette chromosome mec, SCCmec)分型 SCCmec分型是基于对ccr和mec基因复合物的检测结果, 以下金黄色葡萄球菌作为SCCmec 分型的阳性对照菌株:NCTC 10442(type Ⅰ )、N315(type Ⅱ )、85/2082 (type Ⅲ )、JCSC4744(type Ⅳ )和D12(type Ⅴ )。参考Cai等[7]建立的研究方案, 运用多重聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)进行SCCmec分型。

4.金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcus protein A, SPA) 基因分型 采用引物1113F(5'-TAAAGACGATCCTTCGGTGAG-3')和1514R(5'-CAGTAGTGCCGTTTGCTT-3')扩增spa基因, 并送上海生物生工公司测序分析, 金黄色葡萄球菌的spa型通过在线数据库比对获得(http://www.spaserver.ridom.de/)[8]。

5.PV杀白细胞素 (Panton-Valentine leuko-cidin, PVL) 基因的检测 pvl基因用以下引物扩增:pvl-1(5'-ATCATTAGGTAAAATGTCTGGA-CATGATCCA-3')和Npvl-2 (5'-GCATCAASTG-TATTGGATACCAAAAGC-3')[9]。

spa和pvl 的PCR反应条件为:94 ℃预变性10 min, 然后94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min, 进行30个循环, 最后72 ℃延伸10 min。spa目的片段大小在300 bp左右, pvl目的片段为433 bp。

结 果
一、体外药物敏感性试验

43株金黄色葡萄球菌中MRSA 21株, 约占48.8%, 无万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺耐药菌株, 对抗菌药物的耐药率见表1。

表1 43株金黄色葡萄球菌对抗菌药物的耐药率(%)
二、SCCmec分型

21株MRSA中, SCCmec-Ⅲ 20株, SCCmec-Ⅳ 1株, 见表2。

表2 43株金黄色葡萄球菌抗菌谱及分子特征
三、spa分型

MRSA的spa型别比较集中, 主要为t030型(19株), 其次为t571型(9株), t037型、t1451型、t11685型和t127型各有2株, t2310型1株, 见表2。t030-Ⅲ 型别菌株中47.4%(9/19)的菌株来自于重症监护病房。

四、PVL的检测

在MRSA中未检测到pvl基因阳性菌株, 在MSSA菌株中有较高的pvl基因携带率, 近60%(13/22)的MSSA中检测到pvl基因, 这些菌株中7株分离自脓液标本、4株分离自血液标本、1株分离自尿液标本、1例分离自痰液标本。且13株pvl基因阳性菌株中, 9株(69.2%) spa型别为t571, 其余菌株中2株为t1451, 1株为t3085, 1株为t309。

讨 论

MRSA是医院感染的重要病原菌, 在上海地区2009至2011年, 5.7%的血流感染由金黄色葡萄球菌引起[10]; 国外报道也认为MRSA是医院环境中最重要的6种病原体之一, 在美国仅2005年就有近95 000例MRSA引起的侵袭性感染[10, 11, 12]。在本研究的43株金黄色葡萄球菌中, 21株确认为MRSA, 约占全部菌株的50%, MRSA和MSSA两组菌株对氨基糖苷类(庆大霉素和妥布霉素)、克林霉素和利福平的耐药率存在差异, 而对其他检测药物的耐药性无差异。

金黄色葡萄球菌耐药克隆的播散在细菌耐药性的发展中占有重要的地位, 借助于分子生物学研究手段的发展, 基于细菌分子流行病学特征基础上的细菌耐药性分析数据逐渐增多, 在本地区目前尚缺乏基于金黄色葡萄球菌分子生物学基础上的耐药分析数据, 本次研究通过spa和SCCmec分型发现t030-Ⅲ 菌株为该地区主要的MRSA克隆株, 该型菌株多属于序列型ST239或ST246 (http://spa.ridom.de/spatypes.shtml), 而ST239 (CC8)目前被认为是中国最主要的MRSA克隆(http://saureus.mlst.net/earth/maps/), 这与国内其他地区非常相似, 该型目前报道主要分布于亚洲和欧洲的多个国家, 如中国、德国、伊朗、荷兰、保加利亚和塞浦路斯等(http://spa.ridom.de/spa-t030.shtml)。在海安地区该spa型的MRSA又可分为2个耐药谱型, 即P-CX-CN-TOB-E-CC-RA和P-CX-CN-TOB-RA, 这2个耐药谱型的菌株均对氨基糖苷类和利福平耐药, 但对红霉素/克林霉素的耐药性不同, 针对这2个主要耐药株, 有效的抗感染治疗有赖于糖肽类或利奈唑胺进行治疗。且本次研究发现t030-Ⅲ 型别菌株中近半数(47.4%)来自于重症监护病房, 提示着克隆传播的可能性。

PVL相关报道最早出现于1932年, 目前认为pvl基因阳性的菌株与一些感染性疾病的症状和严重程度有关, 但致病机制尚不清楚。携带pvl基因也被认为是社区获得性MRSA的特征, 在本次研究中未发现携带pvl基因的MRSA, 但发现近60%的MSSA携带pvl基因, 与spa分型结果结合分析后发现, 13株pvl基因阳性菌株中有9株(69.2%)spa型别为t571, 呈明显的集中趋势。这13株pvl基因阳性的MSSA中的12株分离自脓液、血液和尿液, 分离痰液的仅1株, 由于患者信息不充分, 目前尚无法确认与不携带pvl基因的菌株相比, 这些pvl基因阳性菌株所引起的感染情况是否更为严重。

本次研究对来源于江苏中部地区分离的金黄色葡萄球菌进行了分子流行病学、细菌耐药性及PVL毒力因子携带等状况分析, 为金黄色葡萄球菌感染症的抗感染治疗方案的选择提供了依据, 也为未来该地区更大规模的流行病学调查的开展奠定了基础。

The authors have declared that no competing interests exist.

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