引用本文
滕贤麟, 施金俏, 郭辉, 周燕霞. 无精症及严重少精症患者染色体核型和Y染色体微缺失分析. 29(12): 1212-1214
TENG Xianlin, SHI Jinqiao, GUO Hui, ZHOU Yanxia. Analysis on chromosome karyotypes and Y chromosome microdeletions in patients with azoospermia or severe oligozoospermia. Labratory Medicine, 29(12): 1212-1214  
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无精症及严重少精症患者染色体核型和Y染色体微缺失分析
滕贤麟, 施金俏, 郭辉, 周燕霞
浙江省金华市人民医院检验科,浙江 金华 321000

作者简介：滕贤麟,男,1978年生,学士,主管技师,主要从事临床检验工作。

摘要
目的

分析男性不育中无精症及严重少精症患者染色体核型和 Y染色体微缺失情况及分布特点,为卵细胞浆内单精子注射术(ICSI)辅助助孕前提供遗传学筛选依据。

方法

对150例无精症及严重少精症患者外周血液采用外周血淋巴细胞培养G显带方法进行染色体核型分析,采用多重聚合酶链反应(PCR)结合琼脂糖凝胶电泳检测Y染色体微缺失。

结果

150例无精症及严重少精症患者,染色体核型异常14例,异常率9.3%;Y染色体微缺失16例,异常率10.7%。

结论

对无精症及严重少精症患者进行染色体核型分析和Y染色体微缺失检测,可为患者在ICSI辅助助孕前提供筛选依据,避免在ICSI治疗中将遗传缺陷传递给子代,同时减少患者精神上和经济上的负担。

关键词: 染色体; 核型; Y染色体微缺失; 无精症; 严重少精症
中图分类号:R446.11 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2014)12-1212-03
Analysis on chromosome karyotypes and Y chromosome microdeletions in patients with azoospermia or severe oligozoospermia
TENG Xianlin, SHI Jinqiao, GUO Hui, ZHOU Yanxia
Department of Clinical Laboratory, Jinhua People's Hospital, Zhejiang Jinhua 321000, China
Abstract
Objective

To investigate chromosome karyotypes and Y chromosome microdeletions and their distribution characteristics in patients with azoospermia or severe oligozoospermia, in order to provide the reference for genetic screening of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) before pregnancy.

Methods

A total of 150 patients with azoospermia or severe oligozoospermia were enrolled. Chromosome karyotype analysis was performed on peripheral blood lymphocytes with G-banding. Y chromosome microdeletions were detected by multiplex polymerase chain reaction (PCR) combined with agarose gel electrophoresis.

Results

There were 14 cases of abnormal chromosome karyotypes and 16 cases of Y chromosome microdeletions in 150 patients with azoospermia or severe oligozoospermia, and the abnormal rates were 9.3% and 10.7%, respectively.

Conclusions

For patients with azoospermia or severe oligozoospermia, the chromosome karyotype analysis and Y chromosome microdeletion determinations could provide genetic screening reference before performing ICSI treatments, avoiding the genetic deficiency being passed to offspring and reducing the patients' mental and economic burdens.

Keyword: Chromosome; Karyotype; Y chromosome microdeletion; Azoospermia; Severe oligozoospermia

据世界卫生组织调查显示, 全世界有15%的夫妇患有不孕不育症, 其中男性因素占40%~50%, 而30%的男性不育是由遗传因素引起的生精障碍[1], 表现为无精或少精。男性不育遗传因素主要包括三方面:(1)染色体核型异常, 如克氏症47, XXY; (2)Y染色体微缺失, 如AZFb缺失; (3)基因突变, 如囊性纤维化病等。目前, 对无精症及严重少精症患者辅助生育的有效治疗方法是卵细胞浆内单精子注射术(intracytoplasmic sperm injection, ICSI), 精子的主要来源是精液中排出的少量精子, 也可以通过睾丸细针穿刺术或经皮附睾穿刺抽吸取精术获取。这些技术的应用, 使自然选择的过程大大减少, 增加了将父代的遗传缺陷垂直遗传给男性子代的风险。因此, 精子异常的不育患者在ICSI辅助助孕前都应常规进行遗传学筛查, 包括染色体核型分析和Y染色体微缺失检测。我们通过对金华地区150例无精症及严重少精症患者的染色体核型分析和Y染色体微缺失检测, 旨在分析其异常发生的分布和频率, 为不育患者在ICSI治疗前提供必要的遗传咨询。

材料和方法
一、 材料

1.研究对象 2010年5月至2012年12月来金华市人民医院生殖中心就诊的150例无精症或严重少精症患者(按照世界卫生组织标准连续3次精液常规分析确诊), 年龄25~38岁; 正常对照20名(年龄25~35岁), 分别采取2份外周血标本, 1份乙二胺四乙酸抗凝用于Y染色体微缺失分析, 1份肝素抗凝用于染色体核型分析。

2.仪器和试剂 (1)试剂: DNA提取和扩增试剂购自深圳亚能生物技术有限公司, 试剂批号20100401; RPMI1640培养基为湖南湘雅基因技术有限公司, 试剂批号20100326; (2)仪器:美国伯乐公司的MJ PTC-200型聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增仪 , 江苏兴化市仪器厂的DY-1A稳流稳压电泳仪。

二、方法

1.外周血染色体检查 取正常人和患者外周血做淋巴细胞培养, 制片, G显带核型分析, 镜下计数30个分裂相, 分析3~5个核型, 异常核型做加倍分析, 结果分析按照人类细胞遗传学国际命名体制进行。

2.Y染色体微缺失检测 取患者乙二胺四乙酸抗凝血, 按照全血细胞DNA提取试剂盒说明提取DNA。根据AZF区所检测的15个特异性标签序列位点的片段大小进行适当组合, 分成4管(Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ 、Ⅳ )进行PCR扩增, 每管采用性别决定因子作为内控, Ⅰ 管为SY254、SY143、SY242、SY255, Ⅱ 管为SY84、SY239、SY152, Ⅲ 管为SY86、SY127、SY145、SY124, Ⅳ 管为SY134、SY82、SY128、SY133。按照试剂说明书进行扩增, 扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测, 每管扩增产物均能跑出内控带, 根据电泳跑出的条带和正常男性的标准条带进行对比, 从而得出是否有缺失及缺失位点。

本研究中, 检测人员2009年5月经浙江省临床检验中心举办的PCR培训班取得PCR上岗证。PCR实验室于2004年通过卫生部验收, 2009年通过复审。具有开展Y染色体微缺失的条件和资质。

结 果

150例无精症及严重少精症患者染色体异常核型14例(9.3%), Y染色体微缺失16例(10.7%), 20名正常对照者未见异常核型和Y染色体微缺失, 具体结果见表1; 14例染色体核型异常中染色体数目异常4例, Y染色体长臂缺失3例, 平衡易位5例, 臂间倒位1例, 环形染色体1例, 见表2; 16例Y染色体微缺失中c、d座位联合缺失13例, b、c、d座位联合缺失2例, b座位缺失1例, 见表3。可见, 无精症及严重少精症组的染色体核型异常率和Y染色体微缺失率都显著高于精液正常对照组。

表1 150例无精及严重少精症患者核型和Y染色体微缺失检测结果
表2 无精症及严重少精症患者染色体核型分布
表3 无精症及严重少精症患者Y染色体微缺失分布
讨 论

导致男性不育的各种因素中遗传因素近占三分之一, 染色体核型异常和Y染色体微缺失为常见遗传因素。本研究在无精及严重少精症患者中检测到染色体核型异常, 发生率为9.3%, 与孙宝刚等[2]研究报道的9.3%结果相近; Y染色体微缺失发生率为10.7%, 与杨欢利等[3]报道的9.6%结果相近。本研究发现导致男性无精或少精的染色体异常核型中以Klinefelter综合征(47, XXY)和Y染色体长臂缺失为主。47, XXY 染色体异常核型较正常男性多了1条X 染色体, 使睾丸的发育受到影响, 睾丸功能萎缩, 临床表现有睾丸发育不良、无精子、第二性征发育不良等。本研究中检出46, XY, del(Y)3例, 其Y的长臂明显短于正常, 有微小的缺失。由于男性生殖器官的发育和成熟是Y 染色体上睾丸决定因子和睾丸成熟因子等一系列基因的协调作用, 染色体结构异常均会造成基因片段缺失或重复, 基因协调受阻而导致无精症或严重少精症[4]。染色体平衡易位由于没有发生遗传物质的丢失, 所以患者的表型正常。有报道平衡易位也可以引起不育, 可能是同源染色体在减数分裂前期不能联合, 引起配子染色体大片段遗传物质的重复和缺失, 导致基因组不平衡, 引起配子死亡, 造成少精子症或无精症[5]。另外, 1例常染色体结构异常的病例为9号染色体的臂间倒位, 对于9号染色体倒位在不孕、不育中的作用一直存在争议, 尚无明确的定论[6]。因此, 该例少精子症是否由9号染色体倒位引起还有待进一步深入研究。可见, 染色体的核型异常可以导致男性的无精或少精, 其中一部分核型异常如Klinefelter综合征表现为无精症, 几乎无法从睾丸穿刺取得精子, 在ICSI辅助助孕前就需要选择供精; 而有部分如平衡易位患者因其生殖细胞会出现遗传物质的重复或缺失, 需要选择第3代试管婴儿技术, 即需要做植入前诊断; 而一般的生殖中心只能做第2代, 因此在ICSI辅助助孕前做染色体核型分析除了可以避免把遗传缺陷传给子代, 还可以帮助患者减少精神上和经济上的负担。

Tiepolo等[7]首次发现了Y染色体长臂1区1带存在精子发生相关基因, 称为无精子因子, 后来有学者提出将无精子因子分为:无精子因子a、无精子因子b、无精子因子d、无精子因子c 4个功能区, 每个功能区在男性生殖细胞发育的不同时期起着重要的作用, 不同区域的缺失有着不同的临床表现。无精子因子a缺失导致精子在青春期前发生阻滞, 表现为唯支持细胞综合征, 临床还表现为无精子生成。无精子因子b缺失导致在减数分裂前期或减数分裂中精子生长阻滞, 停留在精母细胞阶段, 睾丸内可见精原细胞和初级精母细胞 , 没有精子生成。无精子因子c缺失者的临床表现呈多样化, 可从正常精子到无精子各种表型。无精子因子d缺失可导致不同程度的生精障碍。本研究发现Y染色体微缺失以无精子因子c和无精子因子d缺失为主, 这也是热点缺失区域[8], 无精子因子b缺失相对较少, 未发现无精子因子a缺失。这类有Y染色体微缺失的无精症或严重少精症患者, 若是无精子因子a和无精子因子b完全缺失患者, 几乎不能从睾丸内获得精子, 只能选择供精, 因此在辅助助孕前进行 Y 染色体微缺失检测, 可减少不必要的睾丸穿刺取精, 可降低患者身体、精神上的伤害及减少经济负担。对于无精子因子c和无精子因子d 缺失但尚有精子的患者, 其精子数目有进行性下降的趋势, 部分患者最后发展为无精子症, 此类缺失患者应及早治疗或将精液进行冷冻保存, 避免发展到无精症时进行有创伤的取精, 且在ICSI辅助助孕时需要选择女性胚胎, 以免将缺失遗传至下一代。

随着辅助生殖技术的发展, 为越来越多的不育患者获得后代提供了机会, 特别是一些无精症或严重少精症患者只有通过ICSI才能有机会获得自己的后代。但是通过ICSI助孕的方式越过了一些自然淘汰的屏障, 具有将亲代的一些遗传缺陷垂直传递给子代的风险。因此建议在ICSI治疗前均应先做染色体核型分析和Y染色体微缺失检测, 如有核型异常或无精子因子缺失, 为不育患者是否行ICSI治疗或行ICSI治疗时用种植前的遗传诊断选择女婴提供遗传咨询, 尽量避免把遗传缺陷传给后代。

综上所述, 在无精症和严重少精症的男性不育患者中, 染色体核型异常和Y染色体微缺失是导致不育的重要遗传因素。因此, 需要对这类患者进行染色体核型分析和Y染色体微缺失检测, 为辅助生殖提供遗传咨询和制定合理的治疗方案提供依据。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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