1.仪器安装 应以现有的文献为依据, 评价和确认仪器操作的方法学和原理。评价计划应包括对评价机构内部资源可用性的估计。作为初步评价的一个步骤, 应对合适的参考方法、人员评价、统计学工具及对有经验的形态学家作出选择。形态学家预期的工作时间和可用性也应事先予以核定。需建立必须予以评价和选择仪器各项参数的范围。制造商应负责仪器的安装和设置, 而初步校准应按制造商指定方法进行。制造商应将有关校准和用质控品和/或患者标本所做的仪器性能评估的书面报告提供给将进行仪器评估或确认的临床实验室。

2.培训 供应商应对预期的仪器评价者进行培训。培训应覆盖测定原理、仪器操作、维护和故障处理。制造商提供的指导手册应涵盖上述内容且应更详尽。评价项目应包括对指导手册质量和完整性的评价。严格遵循制造商的指导至关重要。

3.血液标本 用于评价的标本应是乙二胺四乙酸钾盐(按制造商规定使用, EDTA-K₂或EDTA-K₃)抗凝的新鲜人全血, 并记录抗凝剂的浓度。最少使用血量应按制造商的建议, 满足自动和手动2种模式的检测用量, 包括死腔血量。除用于评估标本稳定性外, 血液标本应在静脉采血后4~8 h内进行处理。标本运输和贮存应满足适用的国际/地区性安全技术规章。在所有其他实验检测完成前, 应保存剩余的血液标本, 评价结束后才能丢弃。不应记录捐血者的身份, 只有数字编码系统的标本才能用于仪器之间和方法之间的比较。只要患者身份不被识别, 允许保留其临床信息。而临床信息对研究病理标本是必须的。应有计划确保可使用各种定量和定性的异常标本。待测标本应涵盖整个临床可报告范围(clincally reportable interval, CRI), 且应包括临床实验室所遇见的异常程度最严重的标本。标本应包含可能的各种干扰物, 如脂肪、高胆红素、溶血或冷球蛋白。表1列举了各种疾病和干扰物, 但并非在所有仪器上均有这些参数。虽然必须弃用肉眼可见凝块的标本, 但应接受那些有血小板凝块和/或红细胞凝集及镜下检出凝块的标本。此类标本可用于评估仪器血小板凝集的报警功能。评价所用的标本来自正常个体或无病个体的标本应占1/3~1/2。在评价中, 正常标本的比例过高或过低, 可比性结果均可能不可靠。

4. 血涂片 每份标本应按临床实验室标准操作规程至少制备2张血涂片。对于数字成像分析系统来说, 需按制造商的指导优化染色操作。

5. 记录 所有结果, 包括质控数据的准确记录均应保存于工作表或计算机的电子表格上。在有些国家/地区还强制性要求保存仪器打印的原始结果以备用。应保存仪器停机、发生故障的任何原因、服务响应时间和保养计划的记录。应使用带有操作者姓名和专业水平的操作日志, 记录仪器所遇到的任何故障及试剂、质控物的使用、批号和失效期等事项。

有关仪器的安全性应征求制造商的建议, 而此类建议通常包含在仪器操作手册内。在开始评价前, 应评估仪器的安全性, 也应评价和记录健康和安全、所涉法律和保险问题、数据的贮存和安全性、有效性和易操作性等问题。应考虑预期使用仪器人员的技能水平以及成本效益。如存在下列任何电子类、机械类或化学类的缺陷均应暂停仪器评价。

表1

表1

表1 血液分析仪评价中应包含的异常标本和潜在干扰物 白细胞 红细胞 血小板 干扰物质 极度白细胞增多 镰状红细胞 巨大血小板 溶血 极度白细胞减少 靶形红细胞 血小板聚集 冷球蛋白 中性粒细胞增多 淋巴细胞增多 单核细胞增多 嗜酸性粒细胞增多 嗜碱性粒细胞增多 原始细胞 红细胞碎片 未成熟血小板 异常蛋白 非典型淋巴细胞 小红细胞 CD61标记血小板 高胆红素 涂抹细胞 巨大红细胞 脂血 未成熟粒细胞 球形红细胞 左移/杆状核中性粒细胞 极度红细胞增多 CD3/CD4/CD8淋巴细胞 极度贫血 有核红细胞 网织红细胞增多 未成熟网织红细胞分数(IRF) 网织红细胞血红蛋白浓度/含量低下 Howell-Jolly小体 Heinz小体 Pappenheimer小体 疟原虫

表1 血液分析仪评价中应包含的异常标本和潜在干扰物

1. 电子 有关电子特性应符合适用的国际/国家标准, 如德国安全认证(Geprufte Sicherheit, GS)标志、欧洲CE标志、美国国立标准学会(American National Standards Institute, ANSI)标准、美国保险商实验室安全标准(Underwriters Laboratories, UL)清单、日本工业标准(Japanese Industrial Standards, JSA)以及加拿大标准协会(Canadian Standards Association, CSA)标志。另外, 制造商也可引用仪器所遵循的各种国际标准。

2. 机械 机械核查应包括任何可引起伤害的危害, 如暴露的运动部件和尖锐的边缘。

3.化学 应考虑到所有的试剂可能均有腐蚀性、致癌性或毒性, 如测定血红蛋白的氰化试剂。对使用的所有试剂必须进行完整的“ 有害健康物质控制” (control of substances hazardous to health, COSHH)评估, 并提供材料安全性数据表信息。虽然各国的安全性标识要求有所不同, 但这些标识必须符合当地的要求。任何试剂上市前均应标识为仅用于性能评价或仅供研究之用。

4.微生物 理想的标本分析应是闭盖进样分析。对所有仪器的感染性气溶胶均应进行检测。制造商应使用细菌荧光示踪剂检测气溶胶和表面污染, 以便对微生物进行评估。所有程序应遵照适用的法规。操作规程还必须含有设备灭菌、去污染、溢出防护及废弃物和标本处置的内容。

应评价条形码或手工录入标本的识别方式。整个评价过程中应监测条形码阅读仪的可靠性, 包括数据和图形的清晰度、过程的确认、质控程序、数据的贮存和检索。

1.进样模式 当仪器采用独立进样路径(如闭盖自动进样、手工开盖或预稀释进样)的多种进样模式时, 应测试所有模式的性能。应评价仪器所有模式的精密度、携带污染和线性(或制造商声称的各种参数)以及一定数量标本(至少30份)的不同进样模式间的可比性。

2.精密度 精密度是指一份标本重复多次测定所得检测结果之间的一致性。它取决于随机误差的分布而非准确度的测量。细胞浓度越低, 被计数的细胞数量就越少, 因此计数的不精密度就越大。不精密度可报告为标准差(s)或变异系数(coefficient of variation, CV, 即用同一份标本在短时间内重复测量的s与均值的百分数来表示)。s或CV增大提示不精密度增大。在临床实践中, 应建立每个参数整个可报告范围的精密度, 包括低值计数, 特别是在血红蛋白和血小板输血的阈值附近。(1)批内精密度(within-run precision):批内精密度即可重复性, 通常由同一标本在一个批次内重复测定10次得到。批内精密度应包括所有分析报告的参数。白细胞计数、血红蛋白量和血小板计数应获取正常值、异常低值和异常高值的标本。高值和低值标本应是临床实验室遇见过的、超出参考区间上限和下限的标本, 如化疗、红细胞增多症或未治疗的白血病患者。若仪器报告网织红细胞计数或NRBC, 则应检测临床决定值附近的标本。必须收集所有仪器报告参数的精密度数据, 而不仅仅是上述参数数据。应计算精密度的均值、s和CV。(2)批间精密度(between-batch precision):批间精密度受仪器校准或偏移的影响。同一标本每天测定1次, 重复测定20~30 d, 得到所有分析参数的天间(批间)总精密度。和批内精密度一样, 适当时, 应包括白细胞计数、血小板计数、网织红细胞计数、血红蛋白和NRBC的异常低值和异常高值标本的批间精密度。标本需要保存一段较长的时间, 因而可能需要使用经固定的血液标本。使用制造商提供的适用于此目的质控物较为方便, 可用于评估仪器的所有参数。对某些参数和某些制造商来说, 因没有特定的室内质控物可用, 临床实验室应谨慎处理这些参数的报告。当这些标本在每天的任何时间段分析时, 必须考虑高值或低值标本的携带污染影响, 并按携带污染评价要求独立评价携带污染。

3.携带污染 携带污染为前一标本对其紧接的后一标本分析的污染。临床关注的是在常规检测中, 高值标本可能使随后检测的细胞较少的标本或贫血标本的结果升高。应评价高值标本对低值标本的携带污染。通常的做法是检测高值标本(标本A)3次, 得到A1、A2和A3, 随后检测低值标本(标本B)3次, 得到B1、B2和B3。对白细胞计数、血小板计数、网织红细胞计数、血红蛋白和NRBC参数来说, 应至少测定3次。携带污染(%)= B1-B3A3-B3× 100。

4. 线性 监管部门要求在用于患者标本检测前, 临床实验室应确认仪器的可报告范围。假设仪器没有恒定的偏移, 则线性为仪器直接提供与细胞浓度呈正比结果的能力。不同稀释度测定参数的线性范围应越宽越好。应选择整个分析测量范围从最高值到最低值的各种稀释度。若临床实验室曾遇到极低浓度白细胞计数和血小板计数时, 最好对低浓度标本的线性进行独立评价。如取血小板50× 10⁹/L做系列稀释到5× 10⁹/L, 取白细胞2.0× 10⁹/L做系列稀释到0.2× 10⁹/L。即使是空白浓度(如从100%到0%, 则以10%为递减量)也应重复测定标本得到相应结果。AB型血清或仪器稀释液可作为稀释剂。某些血液学参数, 如红细胞指数或可报告结果为百分数, 则不受标本稀释的影响。当患者标本不可用时, 某些制造商提供的线性核查品可用于可报告范围的确认, 如Streck(International@streck.com)和R& D Systems(CustomerService@RnDSystems.com)。作为仪器评价的一部分, 还应评价分析测量范围(analytical measurement interval, AMI)和CRI。AMI是指不做稀释、浓缩或其他非常规预处理操作, 对标本直接测定所得的测量范围。有时AMI可认为是线性的同义词。可通过评估已知异常高值和低值的患者标本或使用已知高值和低值的校准品完成对AMI的验证。患者标本检测结果的CRI是测量方法可检测的分析物测定值的范围, 即允许对标本进行稀释、浓缩或其他预处理, 用于扩大直接AMI。CRI是基于诊断需求和临床实验室发布的临床决定值, 与临床实验室内的稀释和浓缩程序有关。可使用已知异常高值或低值的患者标本或使用已知低值或高值的校准品来验证CRI。应注意的是, 仪器的精密度将影响线性结果, 这在评价线性之前就必须加以考虑。因此, 精密度评价最好先于线性评价。从精密度和线性的测定程序以及仪器的偏移可测得空白限(limit of blank, LoB)和检测限(limit of detection, LoD)。此对于标本中浓度极低的白细胞计数、红细胞计数、血小板计数及体液细胞计数可能更为重要。线性评价还应绘制线性回归图, 其X轴为标本的浓度、Y轴为细胞的计数或浓度。回归线应通过原点, 相关系数(r)应尽可能接近1.0。由于统计学的原因, 低值细胞计数的变异性总会显得较高。

5.标本稳定性 标本稳定性是指在规定的一个时间段和特定的限值内, 在规定条件下贮存的标本维持所测量值一致性的能力。众所周知, CBC各种成分的数量随静脉采血后的时间而变化, 其检测结果可能变高或变低。要测定CBC或分类计数参数的变化, 须采用5份正常个体标本和5份异常而非相同细胞系列的患者标本。在采集的零时间点(或尽可能接近此时间点)即作分析, 然后将血液标本分装成2套, 每套6瓶, 一套贮存在室温(应做记录), 另一套贮存在4 ℃, 随后在4、8、12、24、48和72 h后分别检测标本。注意, 应让贮存在4 ℃的标本回复到室温后再检测。通过计算各时间点测定结果与初始(零时间点)检测结果的差值, 得到检测结果-检测时间图, 以评估贮存时间和温度对结果的影响。检测结果精密度的影响也应考虑, 而且应进行独立评估。

6. 参考区间 要确立一台仪器对疾病的诊断、筛检和监测的临床效用, 临床实验室有必要建立参考区间。在仪器评价期间, 应计算此仪器全部CBC参数的特定参考区间。在理想情况下, 应在静脉采血后4 h内完成至少120份(男、女性各60份)明显正常的个体标本的检测, 应包括所有CBC和分类参数的测定值。如有可能, 应考虑性别和种族分组。应特别注意的是, 要确保合适的静脉采血技术、适当的压脉带使用时间和充足的静脉血流, 避免血液浓缩和凝固。如需要, 应建立新生儿以及不同年龄儿童的参考区间。每组应计算均值、s和95%可信区间。若组内数据呈正态分布(非偏态分布), 那参考区间就是从参考区间的下限(均值-2s)到上限(均值+2s)。若测定结果不呈正态分布, 则采用Mann-Whitney U检验, 用百分数和可信限来表示参考区间。只有在完成参考区间检测后, 实验室的剩余标本才可用于其他检测。但若要对志愿者采血, 则应按地区性伦理准则寻求志愿者的知情同意。

(未完待续)