引用本文
孙康德, 陈旭, 虞中敏, 陈福祥. 碳青霉烯类耐药克雷伯菌属细菌的药物敏感性及同源性分析. 29(11): 1136-1140
SUN Kangde, CHEN Xu, YU Zhongmin, CHEN Fuxiang. Drug suspectibility and homology analysis of carbapenem-resistantKlebsiella spp . Labratory Medicine, 29(11): 1136-1140  
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碳青霉烯类耐药克雷伯菌属细菌的药物敏感性及同源性分析
孙康德, 陈旭, 虞中敏, 陈福祥
上海交通大学医学院附属第九人民医院检验科,上海 200011

作者简介:孙康德,男,1966年生,硕士,副主任技师,主要从事微生物检测和细菌耐药性的研究。注:孙康德和陈旭对本研究具有同等贡献,并列为第一作者。

通讯作者:陈福祥,联系电话:021-23271699-5376。

摘要
目的

探讨碳青霉烯类耐药的克雷伯菌属细菌的耐药机制,了解获得性碳青霉烯类耐药克雷伯菌属细菌流行状况,建立克雷伯菌属细菌的脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型数据库,以便在发生医院暴发流行时快速溯源,为控制该类细菌的传播提供技术支撑。

方法

收集碳青霉烯类耐药的克雷伯菌属细菌,用改良Hodge试验和聚合酶链反应(PCR)分别测定其表现型和基因型;用PFGE对其进行同源性分析。

结果

碳青霉烯类耐药的克雷伯菌属细菌的耐药机制以产碳青霉烯酶(KPC)为主,PFGE分析的8株肺炎克雷伯菌可分成A、B两种PFGE型,其中A型4株、B型4株。

结论

产KPC是本院克雷伯菌属细菌耐碳青霉烯类抗菌药物的主要原因,应重视医院细菌耐药性监测及医院感染的监控。

关键词: 克雷伯菌属; 碳青霉烯类药物; 改良Hodge试验; 聚合酶链反应; 脉冲场凝胶电泳
中图分类号:R378.99 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2014)11-1136-05
Drug suspectibility and homology analysis of carbapenem-resistantKlebsiella spp
SUN Kangde, CHEN Xu, YU Zhongmin, CHEN Fuxiang
Department of Clinical Laboratory, the Ninth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200011, China
Abstract
Objective

To investigate the resistance mechanism and epidemiology of carbapenem-resistantKlebsiella spp., and to establish the pulsed-field gel electrophoresis(PFGE) typing database of carbapenem-resistantKlebsiella spp., in order to provide the reference for rapidly source-tracking and controlling the bacterium spread at the outbreak of nosocomial infection.

Methods

Carbapenem-resistantKlebsiella spp. were collected, and the phenotypic and genetic features were detected by modified Hodge test and polymerase chain reaction(PCR), respectively. PFGE typing was performed for homology analysis.

Results

The main resistance mechanism of carbapenem-resistantKlebsiella spp. wasKlebsiella pneumoniae carbapenemase(KPC)-producing, and there were 2 genotypes by PFGE typing, including genotype A(4 isolates) and genotype B(4 isolates).

Conclusions

KPC-producing is the main reason for carbapenem-resistantKlebsiella spp. in the hospital, and it is necessary to monitor the resistance and to strengthen the infection control.

Keyword: Klebsiella spp; Carbapenem; Modified Hodge test; Polymerase chain reaction; Pulsed-field gel electrophoresis
引言

碳青霉烯类抗菌药物被认为是目前有效治疗高产AmpC β-内酰胺酶(简称AmpC酶)和超广谱β内酰胺酶(ESBLs)多重耐药菌引起严重感染最有效的抗菌药物之一。然而,随着碳青霉烯类药物在临床上的广泛应用,碳青酶烯类耐药的肠杆菌科细菌不断增加[ 1],其耐药机制主要是细菌产生的碳青霉烯酶能够水解碳青霉烯类抗菌药物。肺炎克雷伯菌主要产生肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶( Klebsiella pneumoniae carbapenemase,KPC)。KPC是一种质粒介导的Ambler分类B类酶,能水解几乎所有的β-内酰胺酶和碳青霉烯类抗菌药物。全国范围内已有碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐药机制和分子流行病学的研究报道,而本院尚缺乏相关研究资料。因此,我们收集了碳青霉烯类耐药的克雷伯菌属细菌,用改良的Hodge试验和聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)分别测其表现型和基因型;用脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)对其进行同源性分析,旨在更好地为临床合理用药及感染控制提供有力依据。

材料和方法
一、材料

1.菌株来源

收集上海交通大学医学院附属第九人民医院2013年1月至12月碳青霉烯类耐药的克雷伯菌属细菌9株,其中8株为肺炎克雷伯菌(菌株18,其中6株分离自急诊病区的痰液标本),1株产酸克雷伯菌(菌株9)。碳青霉烯类耐药的克雷伯菌为对任意一种碳青霉烯类药物耐药即可,并剔除同一患者重复分离株。改良Hodge试验阳性质控菌株及 blaKPC基因阳性质控菌株均由复旦大学附属华山医院抗生素研究所惠赠。改良Hodge试验指示菌株大肠埃希菌ATCC25922由本实验室保存;PFGE的标准对照菌株H9812来自于中国疾病预防控制中心传染病控制所。

2.主要设备

VITEK2全自动微生物分析系统为法国梅里埃公司产品,CHEF MapperXA脉冲场电泳仪和Gel Doc XR+凝胶成像仪均为美国Bio-Rad公司产品。

3.主要培养基、试剂和溶液

羊血琼脂平板和中国蓝平板购自上海伊华医学科技有限公司,抗生素纸片为英国OXOID公司产品,VITEK2 GNI和GNS13板条为法国梅里埃公司产品。限制性内切酶XbaI为Takara公司产品,PFGE专用琼脂糖Seakem Gold agarose为美国Cambrex Bio Science Rockland公司产品,蛋白酶K为美国Promega公司产品。细胞悬浮缓冲液(cell suspension buffer, CSB)和细胞裂解缓冲液(cell lysis buffer, CLB)均购自中正惠东医疗技术有限公司。

二、方法

1.菌株鉴定与药敏试验

菌株鉴定和体外药敏试验采用VITEK2全自动微生物分析系统及其配套的GNI和GNS13板条进行。

2.改良Hodge试验

参照美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)2013版指南进行改良Hodge试验。用无菌生理盐水将大肠埃希菌ATCC25922菌悬液调至0.5麦氏单位并进行1∶10稀释,将菌液涂布在MH琼脂平板上,干燥3~10 min,在平板中心贴10 μg美罗培南纸片,接种环挑取待测菌株从纸片的边缘画线到平板的边缘,35 ℃过夜培养,若出现矢状生长为碳青霉烯酶表型阳性。

3.PCR扩增

PCR扩增反应总体积为50 μL,包含DNA模板2 μL、PCR缓冲液5 μL、镁离子4.4 μL、dNTP溶液1 μL、上游引物和下游引物各2 μL,加蒸馏水至50 μL。PCR反应条件为94 ℃变性10 min;94 ℃变性30 s,52 ℃退火40 s,72 ℃延伸50 s,36个循环;最后72 ℃延伸5 min。 PCR引物[ 2]见 表1。

表1 PCR检测相关耐药基因的引物序列

4.PFGE

PFGE按照文献[3]报道的方法进行。主要步骤:细菌定量、制备琼脂糖细菌包埋胶块、细菌裂解、洗涤细菌包埋胶块、限制性内切酶酶切、加样及制备琼脂糖电泳胶和电泳、染色及成像。根据目测条带分析标准认为图谱完全相同为同一型;相差一个条带为同一型的不同亚型;相差2~3个条带为密切相关;相差4~6个条带为可能相关;相差7条以上带条为没有相关[ 3]。

结果
一、 体外药敏试验结果

9株克雷伯菌属细菌的体外药敏结果见 表2。结果表明本院分离的耐碳青霉烯类耐药的克雷伯菌属具有多重耐药性,对氨基糖苷类、喹诺酮类等药物也具有较高的耐药率,而对磺胺类(复方磺胺甲噁唑)耐药率较低。

表2 9株碳青霉烯类耐药的克雷伯菌属细菌体外药敏试验结果
二、改良Hodge试验结果

改良Hodge试验结果显示9株碳青霉烯类耐药的克雷伯菌属细菌均为阳性,实验时阴性质控和阳性质控均在控。

三、PCR扩增结果

PCR扩增结果表明8株肺炎克雷伯菌为 blaKPC基因阳性,1株产酸克雷伯菌为 blaVIM基因阳性,电泳图见 图1。

图1 PCR检测耐药基因的电泳图注:1和14为marker;2和11为阳性对照;3~10依次为8株肺炎克雷伯菌、 blaKPC基因阳性;12为产酸克雷伯菌, blaVIM基因阳性;13为阴性对照

四、菌株的PFGE分型判断标准及结果

8株碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌经XbaI酶切后进行PFGE分析,每个菌株产生15~20条电泳带,大小在20~700 kb之间。

进行PFGE分析的8株肺炎克雷伯菌可分为A、B两型。A型(4株)包括菌株2、4、5、6,B型(4株)包括菌株1、3、7、8,见 图2。A型菌株的条带跨度在20~600 kb之间,特别是在452.7~668.9 kb之间还有2~3条条带;而B型菌株条带跨度在40~700 kb之间。

图2 8株肺炎克雷伯菌株PFGE分析图谱注:1、5、10为标准对照菌株H9812;2、3、4、6、7、8、9、11依次为肺炎克雷伯菌1~8

讨论

碳青霉烯类药物是目前治疗肠杆菌科细菌有效的抗菌药物之一,尤其是对产ESBLs的细菌。一旦碳青霉烯类药物出现耐药无疑会给临床治疗及医院感染的控制带来极大的困难[ 4, 5]。近年来,耐碳青霉烯类药物的肠杆菌科细菌(carbapenem-resistant enterobacteriaceae,CRE)已有许多国家和地区报道[ 4, 5, 6]。我国局部地区也出现CRE的医院暴发流行。碳青霉烯类药物耐药主要可归纳为以下3种耐药机制:(1)产碳青霉烯酶;(2)产AmpC酶和ESBLs合并孔道蛋白缺失和低表达导致的外膜通透性减低;(3)碳青霉烯类药物作用靶位青霉素结合蛋白的改变,其中以第1种和第2种耐药机制为主[ 4]。

本研究分离的9株碳青霉烯类耐药的克雷伯菌属细菌对青霉素类及加β内酰胺酶抑制剂类、头孢类、单酰类、氨基糖苷类、喹诺酮类耐药率较高(几乎均为100%)。但对磺胺类抗菌药物则耐药率很低(22%)。菌株之间对不同的头孢菌素类耐药性有所差异(如菌株4对头孢吡肟敏感,而其他菌株对其耐药)可能是由于除了产碳青霉烯酶外,可能还存在产AmpC酶和ESBLs合并孔道蛋白缺失及低表达导致的外膜通透性减低,其具体机制有待于进一步研究探讨。

目前国际上碳青霉烯类耐药的克雷伯菌属细菌流行的基因型主要有 KPC、 IMP、 VIM、 NDM。我国流行的主要为 KPC和 IMP[ 4]。本研究8株肺炎克雷伯菌和1株产酸克雷伯菌中Hodge试验均阳性,8株肺炎克雷伯基因型均为 blaKPC基因阳性,没有发现其他型别;产酸克雷伯菌为 blaVIM基因阳性。KPC 是近几年发现的一种新型碳青霉烯酶, blaKPC一般位于可转移的质粒上,KPC的水解底物包括所有类型的β内酰胺类药物[ 6]。Yigit等[ 7]于2001 年首先报道在美国北卡罗来纳的1 株分离自1996 年ICARE 监测中的肺炎克雷伯菌中发现KPC-1。目前该酶已在世界各地报道。魏泽庆等[ 8]最早报道了浙江产KPC-2 的肺炎克雷伯菌。刘瑛等[ 9]报道新华医院同一患者不同部位分离的4株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的主要耐药机制为产 KPC-2酶,且本研究中肺炎克雷伯菌均为KPC型,与文献报道相符。

应用拥有稀有酶切位点的限制性内切酶(如XBaI)将细菌染色体DNA切成不同大小的DNA片段进行PFGE,根据酶切的电泳图谱进行聚类分析[ 10]。这种方法被认为是目前细菌分子流行病学研究的“金标准”。该分型技术具有对细菌整个染色体进行分析、分辨率高、重复性好、结果稳定、易于标准化的特点,现已成为许多致病菌的常规分型方法。PFGE分型与流行病学资料相结合可增加对耐药菌的溯源和预警。本研究用XBaI酶作为肺炎克雷伯菌的内切酶,产生的电泳条带较理想,每株约产生14~18条长度在20~700 kb的电泳带,说明本研究所选定的酶和设定的条件适合肺炎克雷伯菌的分型。

PFGE的结果分析主要有目测条带分析和软件分析法。目测条带分析一般认为图谱完全相同为同一型;相差一个条带为同一型的不同亚型;相差2~3个条带为密切相关;相差4~6个条带为可能相关;相差7条以上带条为没有相关[ 3]。根据聚类分析分型:有的文献根据95%来界定区分是否有亲源关系,有的文献根据70%相似度来区分不同的群。我们则根据目测条带分析来区分不同的型,8株肺炎克雷伯菌被分成A、B两型,其中A型菌株4株,占50%(4/8),B型菌株4株,占50%(4/8)。本研究结果表明本院碳青霉烯类耐药的肠杆菌以肺炎克雷伯为主,其耐药基因为 blaKPC。测表现型的改良Hodge试验阳性情况与测基因型的PCR相符合。PFGE分析耐药菌的同源性是一种有效准确的方法。本研究对耐药菌分出了两个菌株较多的PFGE A型和B型。分型结果显示了较强的亲缘关系,虽然菌株数量较少,不能依据本研究结果得出耐药菌的分子流行趋势,但却提示了耐药菌可能有相对集中的亲缘关系。菌株均来自老年患者,以急诊病区为主,标本以痰液为主,且患者均有使用抗菌药物、长期住院等易发生医院感染的危险因素,提示应加强医院感染监控,及做好相应的隔离措施,降低医院感染的发生率。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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