引用本文
蔡刚, 吴蓓颖, 范臻佳, 沈茜. 慢性乙型肝炎患者外周血抗原特异性CD8+T细胞功能的初步分析 . 检验医学, 2014, 29(1): 10-14[CAI Gang, WU Beiying, FAN Zhenjia, SHEN Qian. Primary analysis on the function of peripheral blood HBV-specific CD8+T cells from patients with chronic hepatitis B . Labratory Medicine, 2014, 29(1): 10-14]  
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慢性乙型肝炎患者外周血抗原特异性CD8+T细胞功能的初步分析
蔡刚1, 吴蓓颖1, 范臻佳1, 沈茜2
1.上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科, 上海 200025
2.第二军医大学附属长海医院实验诊断科, 上海 200433
摘要
目的 评价慢性乙型肝炎 (CHB) 患者外周血抗原特异性CD8+T细胞的功能及与临床相关指标的关系。方法 采用主要组织相容性复合物 (MHC)-抗原肽四聚体标记技术检测CHB患者外周血乙型肝炎病毒 (HBV) 抗原特异性CD8+T细胞, 并对其细胞因子分泌能力进行检测, 分析其与临床生化和病毒学指标的关系。结果 35例人类白细胞相关抗原 (HLA)-A基因型为A02或A24的患者中有9例患者至少检出1种被四聚体识别的HBV抗原特异性CD8+ T细胞, 其白细胞介素2 (IL-2) 和γ干扰素 (IFN-γ) 的分泌能力明显低于其自身的外周血总CD8+ T细胞。检出抗原特异性CD8+T细胞患者的血清丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 水平明显高于阴性患者, 而HBV DNA水平低于阴性患者。结论 CHB患者外周血抗原特异性CD8+T细胞存在明显的功能缺陷, 可能因病毒抗原持续刺激造成功能耗竭, 但外周血出现抗原特异性CD8+T细胞仍表明患者体内出现较强抗病毒免疫反应。
关键词: T细胞耗竭; 慢性乙型肝炎; 四聚体技术
Primary analysis on the function of peripheral blood HBV-specific CD8+T cells from patients with chronic hepatitis B
CAI Gang1, WU Beiying1, FAN Zhenjia1, SHEN Qian2
1.Department of Clinical Laboratory, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China
2. Department of Laboratory Diagnosis, Changhai Hospital, the Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
Abstract
Objective To evaluate the function of peripheral blood hepatitis B virus (HBV)-specific CD8+ T cells from patients with chronic hepatitis B (CHB), and assess its relationship with clinical relative parameters.Methods The HBV-specific CD8+ T cells were detected by staining of major histocompatibility complex (MHC)-peptide tetramers in patients with CHB. The HBV-specific CD8+ T cells were analyzed for cytokine secretion ability. The relationship of HBV-specific CD8+ T cells with clinical biochemical and viral indices was analyzed.Results A total of 9 of 35 patients with human leukocyte antigen (HLA)-A02 genotype or A24 genotype had HBV-specific CD8+ T cells recognized by tetramers in peripheral blood. The HBV-specific CD8+ T cells expressed significantly lower interleukin 2 (IL-2) and interferon gamma (IFN-γ) than their counterpart CD8+ T cells. The patients who can be found HBV-specific CD8+ T cells had higher level of alanine aminotransferase (ALT) and lower HBV DNA load than those without HBV-specific CD8+ T cells.ConclusionsPersistent stimulation of HBV antigen is one of the causes of HBV-specific CD8+ T cell dysfunction in patients with CHB. The patients who can be found HBV-specific CD8+ T cells in peripheral blood could have strong anti-virus immunity.
Keyword: T cell exhaustion; Chronic hepatitis B; Major histocompatibility complex-peptide tetramer

尽管伴随大规模疫苗接种, 我国乙型病毒性肝炎的发病率已明显下降, 但就全世界范围而言, 我国仍是乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus, HBV) 的重度流行区域之一。在感染HBV后, 超过90%的成人可从急性感染自愈, 并获得终生免疫保护, 但少数急性患者及儿童患者常进展为慢性乙型肝炎 (chronic hepatitis B, CHB),并可能最终导致肝硬化和原发性肝癌等严重肝脏疾病[ 1]。早期的研究发现, 与急性自限性感染患者不同, 慢性感染患者普遍存在T细胞功能缺陷, 这被认为是病毒难以清除的主要原因[ 2]。随后多项研究证实, 病毒抗原持续刺激所致的抗原特异性T细胞功能耗竭是造成T细胞功能缺陷的重要原因[ 3]。更进一步的研究发现, 这种抗原特异性T细胞功能耗竭的现象不仅出现在多种慢性感染性疾病中, 同时也出现在肿瘤的免疫病理过程中[ 4]。

鉴于抗原特异性T细胞在清除病毒及肿瘤细胞方面具有关键作用, 其功能可能与这些慢性病毒性感染性疾病或肿瘤的预后密切相关, 目前对这方面的研究愈趋重视。人类白细胞相关抗原 (human leukocyte antigen, HLA) 限制性多肽 (或称之为抗原表位) 存在于HBV蛋白质抗原的多肽链中。目前在HBV特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞 (cytotoxic T lymphocyte, CTL) 识别的21个HBV抗原表位中, 有16个是HLA-A2限制性的[ 5]。此外HLA-A*2402是我国人口中常见的HLA-Ⅰ型等位基因之一[ 6]。HBV特异性CTL可以识别主要组织相容性复合物 (major histocompatibility complex, MHC)-Ⅰ类分子与细胞内合成的病毒蛋白肽复合物, 通过对病毒相关抗原表位的识别、活化, 经穿孔素、颗粒酶依赖的途径杀伤感染肝细胞, 或通过Fas/FasL途径启动靶细胞的凋亡, 以及通过细胞因子如γ干扰素 (interferon-gamma , IFN-γ) 等的非细胞杀伤途径抑制病毒的复制。在本研究中, 我们利用MHC四聚体标记技术对CHB患者外周血中HBV抗原特异性CD8+ T细胞的数量和功能进行了初步分析, 并观察其与临床指标的联系。

材料和方法
一、研究对象

经临床确诊的CHB患者35例, 男26例, 女9例, 年龄22~79岁, 中位数45岁, 诊断标准依据2010版国家“慢性乙肝防治指南”[ 7]。所有研究对象的HLA-A等位基因均为A02或A24。所有患者在受试前6个月内均未进行过抗病毒治疗或IFN治疗, 均排除同时感染丙型、丁型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus, HIV) 等。

二、方法

1.试剂及抗体 藻红蛋白 (phycoerythrin, PE) 标记HLA-A2402与HBV 核心 (core) 117~125抗原肽 (EYLVSFGVW) 或HBV聚合酶 (pol) 756~764抗原肽 (KYTSFPWLL) 四聚体 (Tetra) 复合物, PE标记HLA-A0201和HBV core18~27抗原肽 (FLPSDFFPSV) 或HBV包膜 (env) 335~343抗原肽 (WLSLLVPFV 或env348~357 GLSPTVWLSV) 四聚体复合物均购自Proimmune公司;多甲藻叶绿素蛋白 (peridinin chlorophyll protein, PerCP)-Cy5.5-抗 CD19、异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC)-抗白细胞介素2 (interleukin 2, IL-2) 、别藻红蛋白 (allophycocyanin, APC)-抗IFN-γ和 APC-Cy7-抗CD8抗体购自BioLegend和BD-pharmingen公司;高尔基体阻断剂布雷菲德菌素A购自eBioscience公司;穿膜剂saponin购自Invitrogen公司;离子霉素和佛波醇酯购于Sigma公司。淋巴细胞分离液购自上海精华试剂厂。

2.流式细胞术分析 10 mL肝素抗凝静脉血经淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 后, 1×106个PBMC先加入2 μL四聚体进行标记, 室温作用1 h。四聚体标记结束后, 细胞使用磷酸盐缓冲液 (phosphate-buffered saline, PBS) 洗涤。进一步标记PerCP-Cy5.5-抗CD19或APC-Cy7-抗CD8针对膜抗原的抗体, 室温温育30 min, PBS洗涤。需进行胞内细胞因子抗原检测的, PBMC先以终浓度1 μg/mL离子霉素和50 ng/mL佛波醇酯进行刺激5 h, 刺激同时添加终浓度为10 μg/mL布雷菲德菌素A。细胞先标记四聚体和膜抗原, 洗涤后细胞再加入固定穿膜剂500 μL后, 4 ℃作用过夜。PBS洗涤后, 加入FITC-抗 IL-2或APC-抗IFN-γ抗体, 室温孵育30 min。洗涤后, 采用BD公司CantoII流式细胞仪收集细胞, Diva软件进行数据分析。

3.其他指标测定 血清丙氨酸氨基转移酶 (alanine aminotransferase, ALT) 的测定在Beckman Coulter UniCel DxC800系统上完成;HBV表面抗原 (hehpatitis B surface antigens, HBsAg) 等指标的测定在雅培ARCHITECT PLUS i2000系统上完成;血清HBV DNA载量测定采用实时荧光定量聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR),试剂购于深圳凯杰公司, 最低检出限为500 IU/mL。

三、统计学方法

采用Prism5.0软件进行统计学分析。PBMC四聚体标记阳性细胞患者组与阴性患者组之间比较采用秩和检验, 抗原特异性CD8+T细胞与总CD8+ T细胞的比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、CHB患者外周血HBV特异性CD8+T细胞的确定

由于MHC-抗原肽四聚体与淋巴细胞有一定的非特异性结合, 因此我们通过对携带HLA-A02或HLA-24等位基因的正常人PBMC进行标记, 以CD19-细胞设门, 确定以CD8+Tetra+/CD8+≤0.01%作为HBV特异性CD8+T细胞检出的Cut-off值, 因为所有正常供者对照CD8+Tetra+/CD8+ ≤ 0.01%。在全部35例CHB患者中, 共有9例检出针对不同抗原肽抗原特异性CD8+T细胞的病例, 其CD8+Tetra+/CD8+>0.01%(0.33%~2.14%,中位数为0.95%)。见图1:

图1 采用流式细胞仪和四聚体技术检测CHB患者外周血HBV抗原特异性CD8+ T细胞的典型图

二、CHB患者外周血HBV特异性CD8+T细胞效应功能分析

采用胞内细胞因子染色、流式细胞仪分析技术分析HBV抗原特异性CD8+T细胞IL-2和IFN-γ的分泌能力。结果显示, HBV抗原特异性CD8+T细胞IL-2和IFN-γ的分泌能力均显著低于患者自身的外周血总CD8+T细胞(P<0.01),强烈提示HBV抗原特异性CD8+T细胞存在功能缺陷, 见图2。然而, 对比检出HBV抗原特异性CD8+T细胞患者与未检出HBV抗原特异性CD8+T细胞患者的外周血总CD8+T细胞IL-2和IFN-γ的分泌能力, 差异无统计学意义(P>0.05),见图2:

图2 HBV抗原特异性CD8+ T细胞检出患者 (9例) 和未检出患者 (26例)

外周血抗原特异性CD8+ T细胞和总CD8+ T细胞的细胞因子表达分析

三、CHB患者外周血HBV抗原特异性CD8+T细胞检出水平与ALT及HBV DNA载量的关系

对CHB患者外周血HBV抗原特异性CD8+T细胞进行初步功能分析后再对比HBV抗原特异性CD8+T细胞阳性患者与阴性患者血清ALT和外周血病毒载量 (HBV DNA) 的水平。结果显示, HBV抗原特异性CD8+T细胞阳性患者血清ALT水平明显高于阴性患者(P<0.05),HBV DNA载量则显著低于阴性患者(P<0.01),见图3。这一结果提示在HBV抗原特异性细胞阳性患者中可能存在较强的抗病毒免疫反应。

图3 HBV抗原特异性CD8+ T细胞检出患者 (9例) 和未检出患者 (26例) 血清ALT和HBV DNA水平比较

讨论

HBV感染的临床转归与机体免疫密切相关, 其中细胞免疫, 尤其是HBV特异性CTL在病毒清除过程中起着重要的作用。但是, 研究发现HBV慢性感染者体内HBV特异性CTL存在数量和质量上的缺陷, 不能有效地清除病毒。在慢性期抗病毒T细胞反应与急性期状态存在明显不同。急性感染条件下, 抗原特异性T细胞活化后, 其最终命运有2种可能, 一是成为终末分化的效应细胞, 二是成为前体记忆细胞[ 8]。然而, 在慢性感染条件下, 无论是在动物模型还是人类疾病, 抗原特异性效应T细胞功能失调都是一种普遍的现象。持续的病毒刺激造成功能耗竭是效应T细胞功能失调的重要原因[ 3]。在多项研究中已经证实, 程序性死亡蛋白1 (programmed death-1, PD-1) 和B、T淋巴细胞弱化因子 (B and T lymphocyte attenuator, BTLA) 不仅是T细胞耗竭状态的重要表面标志, 亦是导致效应T细胞耗竭的重要效应分子[ 9]。研究证实CHB患者外周血和肝内CD8+T细胞表达PD-1、BTLA (CD8+PD-1+BTLA+)的比例均显著高于正常对照组及疾病对照组, CD8+PD-1+BTLA+T细胞分泌IL-2和IFN-γ的水平显著低于CD8+PD-1-BTLA-T细胞;单独阻断或联合阻断上述分子能有效地恢复CD8+T细胞的效应功能, 包括促细胞增殖、细胞因子分泌[ 10]。本研究发现CHB患者外周血HBV抗原特异性CD8+T细胞IL-2和IFN-γ的分泌能亦显著低于患者自身的外周血总CD8+T细胞。该结果更为明确的证实了CHB感染条件下, 抗病毒T细胞效应功能存在明显的缺陷。

尽管本研究证实CHB患者HBV抗原特异性CD8+T细胞的功能存在明显缺陷, 然而HBV抗原特异性CD8+T细胞阳性患者血清ALT的水平明显高于阴性患者(P<0.05),HBV DNA载量则显著低于阴性患者(P<0.01) 。这些结果提示, HBV抗原特异性CD8+T细胞在外周血的出现, 表明这些患者体内存在较为激烈的抗病毒免疫反应, 体现为HBV抗原特异性T细胞检出阳性患者的HBV病毒载量较检出阴性患者低, 同时其肝功能活动性损伤亦较为严重。有研究显示, 急性乙型肝炎患者外周血HBV抗原特异性CD8+T细胞的检出率明显高于慢性乙型肝炎患者, HBV抗原特异性CD8+T细胞百分率高的患者血清HBV DNA和HBV e抗原的清除要早于HBV抗原特异性CD8+T细胞百分率低的患者, 表明HBV抗原特异性CD8+T细胞在病毒的清除和疾病的自限过程中起重要作用[ 11]。HBV抗原特异性CD8+T细胞究竟对CHB患者疾病的转归有何影响, 还需进行长期的随访观察。

综上所述, 本研究初步分析了CHB患者外周血抗原特异性CD8+T细胞的功能特点及与相关临床指标的关系。对于象CHB这样的慢性感染性疾病, 对病毒特异性T细胞进行功能分析, 可能不仅有助于判断疾病的进程、预测转归, 更有利于认识感染条件下免疫系统与病毒之间的相互作用, 为通过调节免疫功能, 治疗CHB等慢性感染性疾病, 甚至肿瘤等提供新的思路。

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