利用多种抗体同时染色细胞,在单个细胞水平上分析的结果表明,当同时利用2种表面标志物鉴别初始T细胞时,对CD4⁺和CD8⁺ T细胞的特异性约为97%和90%;而同时利用3种表面标志物鉴别初始T细胞时,特异性可分别增加为99%和96%^{[ 3]}。T淋巴细胞是由多种表型和功能不同的细胞亚群组成。根据功能和主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex, MHC)分子的限制性不同,T细胞可分为CD4⁺ 和CD8⁺ T细胞。根据T细胞是否受到抗原刺激,可分为初始、效应和记忆T细胞。效应CD4⁺ T细胞根据功能和细胞因子产生不同又分为不同辅助T细胞(helper T cell, Th),如Th0、Th1、Th2、Th3,和调节性T细胞(tregulatory cell, Treg) 等,CD8⁺ T 细胞又分为不同细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell, Tc),如Tc1 和Tc2 等。与初始T 细胞相比,记忆T 细胞的表型更为复杂。根据归巢受体和组织分布的不同,将记忆CD4⁺ 和CD8⁺ T 细胞分为2个亚群:中央型记忆T细胞(central memory, T_CM)和效应型记忆T细胞(effector memory, T_EM)。T_CM表达趋化因子受体7 (chemokine receptor 7, CCR7) 和CD62L,而T_EM既不表达CCR7,也不表达CD62L。T_CM位于淋巴器官内,当再一次接触抗原刺激时能迅速分裂。T_EM存在于感染部位,对于再次感染能够立即发生反应^{[ 4]}。因此,只利用1~2种参数来鉴别微小细胞亚群会更加困难。

由于T 细胞在功能上具有异质性,而且能够通过多种机制发挥效应。通过IFN-γ 和IL-2 的产生来评价T细胞的应答,抗原特异性T细胞包括多种功能不同的亚群,能够表达不同的这2种细胞因子的组合,而这些不同的细胞亚群与临床和免疫功能相关^{[ 5, 6, 7]}。由于T 细胞具有多种功能,而不仅产生这2种细胞因子,所以还是漏掉了部分抗原特异性细胞亚群。寻找能够充分评价T细胞功能的方法,对于研制针对各种感染和肿瘤预防或治疗性疫苗具有关键的作用。目前,流式细胞术是唯一能够同时分析细胞多种功能的技术,多参数流式细胞术使得人们能够同时评价单个细胞的表型和多种功能,进而更广泛的评价{Invalid MML}。疫苗免疫后或病毒及寄生虫感染后,很多T细胞的免疫反应都采用多参数流式细胞术评价^{[ 9, 10, 11]}。

Th1 细胞主要参与细胞内感染病原菌的免疫应答,包括单独分泌IFN-γ、IL-2 和TNF-α及其不同组合的细胞亚群。产生IFN-γ的T细胞的数量是最为广泛用于评价疫苗免疫后的效果和保护性细胞免疫应答的指标之一^{[ 12]}。IFN-γ在抵御不同的细菌、寄生虫、病毒和真菌感染中发挥着十分重要的作用。然而,单独产生IFN-γ的细胞并不足以提供很好的保护^{[ 13]}。TNF-α能够杀伤各种胞内感染的病毒、细菌和寄生虫。同时产生IFN-γ和TNF-α的Th1细胞能更好的杀伤利什曼原虫和结核分枝杆菌^{[ 14, 15]}。IL-2能够促进CD4⁺ 和CD8⁺ T细胞的增殖。除了产生细胞因子,CD4⁺和CD8⁺ T细胞还通过释放穿孔素和颗粒酶发挥细胞毒功能。检测穿孔素和颗粒酶或CD107a/b分子的表达能够间接反映细胞杀伤活性^{[ 16]}。通常CD107a/b在细胞表面不能检测到,而只存在于细胞毒性颗粒膜的表面。当CD8⁺ T细胞脱颗粒时,CD107a/b会随毒性颗粒的释放与细胞膜融合,通过抗CD107a/b的荧光抗体可以在细胞表面检测到。联合细胞内因子染色,可以检测CD8⁺ T 细胞病毒特异性的细胞因子分泌和杀伤功能。趋化因子如MIP-1β等能够趋化特异性细胞到达感染局部,对于感染具有防御作用。因此,可以通过同时检测5种细胞功能(CD107a/b、MIP-1β、IFN-γ、TNF-α 和IL-2)来分析抗原特异性多功能性T 细胞。

能够分泌多种细胞因子以及具有增殖能力的多功能性T 细胞,在慢性感染中具有更强的免疫功能。有研究发现,在卡介苗免疫后,多功能细胞产生IFN-γ的平均荧光强度是单功能细胞的10倍^{[ 9]}。然而也有研究表明,虽然CD8⁺ T细胞反应对于控制人类免疫缺陷病毒(human immunedeficiency virus, HIV)感染至关重要,但其反应强弱与疾病进展并没有直接关系^{[ 17]}。而HIV特异性CD4⁺ T细胞增殖能力的差异与感染的控制有关^{[ 18]}。

Th1细胞的免疫应答在结核病的保护性免疫应答中起着核心作用。胸膜腔中结核分枝杆菌特异性CD4⁺ T细胞能够同时产生IFN-γ、IL-2、TNF-α 或MIP-1β。这些多功能Th1细胞主要是T_EM,而不是T_CM。CD8⁺ T细胞可能参与了结核分枝杆菌潜伏感染的免疫监视^{[ 19]}和巨噬细胞活化^{[ 20]}。IFN-γ对于抵抗结核分枝杆菌是十分重要的,在结核病患者的外周血细胞中,尤其是在结核分枝杆菌感染部位,IFN-γ的产生是增加的^{[ 21]}。IFN-γ和TNF-α具有招募单核和中性粒细胞的作用,还能促进巨噬细胞的抗菌活性。IFN-γ靶基因敲除的小鼠,更易感染有毒力的结核分枝杆菌。同时在依赖于IL-12的IFN-γ产生通路发生基因突变的人群,对致病性结核分枝杆菌更易感^{[ 22]}。在给予慢性严重的患者抗TNF-α治疗后,易导致具有结核分枝杆菌潜伏感染的患者发展为活动性结核^{[ 23]}。

在南非HIV阴性的结核病患者支气管肺泡灌洗液中,结核分枝杆菌特异性CD4⁺ T细胞具有明显的多功能性^{[ 24]}。在结核感染的活动期,结核分枝杆菌特异性CD4⁺ T细胞的多功能性是增加的,这群细胞能够同时表达IFN-γ、IL-2和TNF-α。而这种多功能性在抗结核治疗后下降,同时分泌IFN-γ和IL-2以及单独分泌IFN-γ的抗原特异性细胞频率增加^{[ 25]}。因此,多功能CD4⁺ T细胞可能是活动期结核的一个重要生物学标志。初始-加强的疫苗免疫策略,也可以产生针对病原菌(如结核分枝杆菌)的多功能记忆CD4⁺ T细胞,能够对这种感染产生长期的免疫^{[ 26]}。如果要理解结核分枝杆菌感染中多功能性T细胞反应,需要做很多纵向的研究,以便确定这些功能与相应临床特征之间的相关性。

在HIV感染过程中,多功能的HIV-1特异性CD4⁺ T细胞多见于非进展期和相对较低病毒载量的HIV-1感染的患者^{[ 27]}。在进展期获得性免疫缺陷综合征患者往往缺乏多功能的细胞亚群。这种细胞亚群能够通过上调穿孔素的表达,直接清除病毒感染细胞,抑制病毒复制。多功能的HIV-2特异性CD4⁺和CD8⁺ T细胞,对于长期控制HIV-2病毒载量在一个很低的水平具有重要作用。

HIV-1特异性的CD4⁺ T细胞增殖能力减弱,只能产生IFN-γ,不产生IL-2。大约60%的HIV-2特异性CD4⁺ T细胞能够同时具有这5种功能中的2种以上,只有不到50%的HIV-1特异性CD4⁺ T细胞具有这种功能^{[ 28]}。尽管IFN-γ和IL-2占据了大部分的HIV-2 特异性的CD4⁺ T细胞反应,但是如果不检测TNF-α、MIP-β和CD107a/b,将有12.9%的HIV-2特异性反应被漏掉。另外,HIV-2 特异性CD4⁺ T细胞反应产生的MIP-1β,可能与HIV-2竞争结合CCR5受体,通过阻断易感细胞的感染控制HIV-2的复制,有利于临床症状的恢复^{[ 29]}。

只检测IFN-γ和IL-2表达并不能很好地体现HIV-1和HIV-2特异性CD8⁺ T细胞反应的差异。HIV特异性CD8⁺ T细胞主要表达CD107a/b、IFN-γ和MIP-1β的不同组合,很少表达TNF-α,几乎不表达IL-2。CD107a/b的表达在HIV特异性CD8⁺ T细胞中占有重要地位,75%的HIV-1和HIV-2特异性CD8⁺ T细胞具有脱颗粒能力,而且这些表达CD107a/b 的细胞并不产生IFN-γ。在HIV-2特异性CD4⁺ T细胞中,不分泌IFN-γ和IL-2,只产生MIP-1β、CD107a/b或TNF-α。产生MIP-1β和CD107a/b的HIV-2特异性CD4⁺ T细胞主要是终末分化的细胞,而产生IFN-γ和IL-2的细胞主要是T_CM,即CD57^-CD27⁺CD45RO^{+[ 29]}。

在小鼠利什曼原虫感染模型中,多功能Th1细胞的形成与保护性免疫应答有关。编码利什曼原虫特异性抗原的疫苗免疫后,或利什曼原虫初次感染后,产生能够分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α的多功能性T细胞,与接受抗原的再次刺激所表现出的保护性密切相关^{[ 9]}。多功能细胞与增强保护性相关。在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)、巨细胞病毒、EB病毒和流感病毒感染的控制中,能够同时产生多种效应功能的病毒特异性CD4⁺ T细胞,可作为保护性免疫的重要标志^{[ 30]}。同时检测多种抗病毒细胞因子和趋化因子等功能,能够更详细地了解抗病毒的T细胞免疫,对于全面评价疫苗诱导的抵抗各种病原菌的T细胞反应也具有非常重要的作用。了解不同细胞亚群,特别是抗原特异性细胞亚群在数量和功能方面的改变,对于疾病诊断和预后,以及疫苗的设计和免疫效果的评价具有重要的指导意义。