引用本文
张景皓, 王家路, 赵虎. 新疆汉族与维吾尔族HBV耐药变异类型与基因型研究. 2014, 29(10): 1041-1044[ZHANG Jinghao, WANG Jialu, ZHAO Hu. Research on the HBV mutational pattern and genotypes among Han and Uighur populations in Xinjiang. Labratory Medicine, 2014, 29(10): 1041-1044]  
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新疆汉族与维吾尔族HBV耐药变异类型与基因型研究
张景皓1, 王家路2, 赵虎1
1.复旦大学附属华东医院,上海 200040
2.新疆医科大学第一附属医院,新疆 乌鲁木齐 830054

作者简介:张景皓,女,1988年生,学士,主要从事临床微生物检验专业研究。

通讯作者:赵 虎,联系电话:021-62483180-20842。

摘要

目的

探讨新疆地区慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒(HBV)耐药变异类型与基因型的关系。

方法

应用聚合酶链反应(PCR)对245例HBV DNA阳性标本进行HBV基因分型。采用基因芯片技术对HBV拉米夫定及阿德福韦酯相关耐药基因突变位点(包括180、204、181、236位点)进行检测。

结果

245例慢性乙型肝炎患者检出HBV基因型B型40例、C型137例、C/D混合型48例、其它型别20例,在不同性别及年龄间的分布差异无统计学意义(χ2=1.791,P=0.617;χ2=14.214,P=0.115),而在不同民族间的分布差异有统计学意义(χ2=83.076,P=0.000)。HBV在180、204、181、236位点的突变检出率分别为33.8%、76.8%、66.9%、45.0%,差异有统计学意义(P<0.05);HBV常见变异类型的基因型构成差异无统计学意义(χ2=14.969,P=0.454),但C型HBV在各变异类型中所占的比例均最高。

结论

HBV基因型在不同民族间的分布不同;HBV常见耐药位点的突变情况不同;HBV基因型在常见变异类型中的分布相同。

关键词: 乙型肝炎病毒; 耐药; 突变; 基因型; 汉族; 维吾尔族
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2014)10-1041-04
Research on the HBV mutational pattern and genotypes among Han and Uighur populations in Xinjiang
ZHANG Jinghao1, WANG Jialu2, ZHAO Hu
1．Huadong Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China
2. The First Affiliated Hospital to Xinjiang Medical University, Xinjiang Urumqi 830054, China
Abstract

Objective

To investigate the relationship between hepatitis B virus (HBV) mutational pattern and genotypes among chronic hepatitis B patients in Xinjiang.

Methods

Genotyping of 245 HBV DNA positive samples was performed by polymerase chain reaction (PCR). Lamivudine and adefovir associated resistant sites (180, 204, 181 and 236 sites) were analyzed by gene chips.

Results

There were 40 cases of HBV genotype B, 137 cases of HBV genotype C, 48 cases of HBV genotype C/D and 20 cases of other HBV genotype among the 245 chronic hepatitis B patients. The distribution was not significant statistically in different sex and ages (χ2=1.791,P=0.617;χ2=14.214,P=0.115), but there was statistical significance in different ethnicities(χ2=83.076,P=0.000). The mutational detection rates for HBV at 180, 204, 181 and 236 sites were 33.8%, 76.8%, 66.9% and 45.0%, with statistical significance (P<0.05). The distribution of HBV genotypes among the common mutational pattern had no statistical difference(χ2=14.969,P=0.454), but HBV genotype C showed the highest proportion among the common mutational pattern.

Conclusions

HBV genotypes have different distribution in different ethnicities. The mutational information in common resistant sites is different. The distribution of HBV genotypes is not different in common mutational pattern.

Keyword: Hepatitis B virus; Drug resistance; Mutation; Genotype; Han population; Uighur population

慢性乙型肝炎患者需要长期乃至终身的抗病毒治疗以达到持续抑制病毒复制的目的。在这种情况下,相当多的患者不可避免地出现了乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)耐药突变株。耐药株的出现大大降低了慢性乙型肝炎的治疗效果。因此,有必要在治疗过程中监测病毒耐药株的出现。基因型是HBV自身的特质,不同人群对病毒的不同基因型的易感和耐受程度不同。新疆地区少数民族多,遗传背景复杂,针对这一地区人群所流行的HBV进行分子生物学的研究,更有利于了解HBV的基因演变及相关的疾病。

材料和方法
一、研究对象

收集新疆医科大学第一附属医院2011年6月至2012年10月门诊及住院慢性乙型肝炎患者327例,诊断标准符合2011年《慢性乙型肝炎防治指南》[ 1],均为采用拉米夫定或阿德福韦酯单用或联用治疗失败而临床考虑耐药者,且拉米夫定或阿德福韦酯单用或联用抗病毒治疗时间均为6个月以上,并在近半年内未用过干扰素和其他免疫抑制剂。排除标准:可引起肝脏疾病的其他疾病,如自身免疫性肝炎、合并丙型肝炎病毒和丁型肝炎病毒感染、原发性胆汁性肝硬化、血色素沉着及其他疾病(如酒精性肝炎和未控制的糖尿病等)。最终纳入研究对象245例,男166例,女79例,年龄2~81岁,汉族160例,维吾尔族85例。本研究符合1975年赫尔辛基宣言原则,经过新疆医科大学第一临床医学院伦理委员会审核批准,并获得每位参与者的知情同意。本研究所在实验室已获得ISO15189认可和临床基因扩增检验实验室技术验证合格证书。

二、HBV基因分型

血清标本的裂解处理、聚合酶链反应(polymerase chain reaction ,PCR)扩增及试验结果的判断均按照上海之江公司提供的HBV基因分型测定试剂盒说明书进行。主要仪器为美国ABI公司的ABI Prism7300扩增仪。

三、HBV耐药基因检测

PCR扩增、杂交、芯片扫描及结果判读均按照博奥生物科技有限公司提供的HBV耐药基因检测试剂盒说明书进行。主要仪器:晶芯RbioMixerTM10K-B芯片杂交仪,晶芯RslidewasherTM10K-B芯片洗干仪,晶芯RluxScanTM10K-B微阵列芯片扫描仪。

四、统计学方法

所有数据均采用SPSS 11.0软件进行统计分析。 HBV不同基因型在性别、民族及年龄间的分布差异采用列联表资料的 χ2检验,率和构成比的比较采用 χ2检验,进一步两两比较用 χ2分割法,并根据比较的次数修正检验水准。以 P<0.05为差异有统计学意义。

结 果
一、HBV DNA基因型分布特征

最终纳入研究的245例慢性乙型肝炎患者,对其感染的HBV进行基因分型,共检出B型40例,占16.3%;C型137例,占55.9%;C/D混合型48例,占19.6%;其它(包括未分型及B、C、D以外的其它型)20例,占8.2%。统计结果显示, HBV基因型在不同性别及年龄间的分布差异无统计学意义( χ2=1.791, P=0.617; χ2=14.214, P=0.115)。HBV基因型在不同民族间的分布差异有统计学意义( χ2=83.076, P=0.000)。其中,汉族患者以C型感染较为常见,构成比为63.8%;维吾尔族患者以C/D混合感染较为常见,构成比为50.6%。见表1。

表1 新疆地区245例慢性乙型肝炎患者HBV基因型分布特征 [例(%)]
二、HBV耐药基因变异分析

245例HBV中,经HBV耐药基因检测得出的突变株有151例,对这151例突变株进行常见耐药位点(包括180、204、181、236位点)的突变检出率比较。统计结果显示,HBV在180、204、181、236各位点的突变检出率分别为33.8%、76.8%、66.9%、45.0%。HBV常见耐药位点的突变差异有统计学意义( P<0.05)。204、181、236各位点以3位点联合突变较为常见,且主要为rtN236T +rtA181V/T+ rtM204V/I联合变异类型。见表2。

表2 HBV常见耐药位点的突变发生情况 [例(%)]
三、常见HBV变异类型的HBV基因型构成情况

拉米夫定和阿德福韦酯是2种常用的抗HBV药物,与这2种药物耐药相关的变异主要有rtL180M、rtM204V/I、rtA181V/T、rtN236T。本研究检出rtL180M变异50例、rtM204V/I变异114例、rtL180M + rtM204V/I联合变异42例、rtA181V/T变异98例、rtN236T变异66例、rtA181V/T+ rtN236T联合变异58例,以上变异类型的HBV基因型构成差异无统计学意义( χ2=14.969, P=0.454),但C型在各变异类型中所占的比例均最高。见表3。

表3 常见HBV变异类型的基因型构成 [例(%)]
讨 论

病毒基因型的差异与人类的迁徙有一定的关联[ 2]。不论是人类还是微生物都表现出由基因漂移而导致的不同的基因特征,微生物基因标志物有可能代替人类基因标志物来研究疾病。基因型是病毒自身的特质,与人类宿主的遗传变异有一定的关系,其在病毒的病理生理学以及病毒在人群中的传播有着重要意义。基于地理学的基因组研究可以加深我们对疾病过程中宿主与病毒相互关系的理解,并对人类病原体的多样性演化及全球性分布有更新的认识。

根据HBV全基因序列异质性≥8%的界限,可将HBV分为不同的基因型。目前已鉴定的HBV基因型有A~H 8个基因型。Yin等[ 3]对中国22个省的81 775例乙型肝炎患者进行了一项多中心的基于社区的大型研究,结果显示这些研究对象所感染的HBV,B型有767例,C型有2 059例,D型有46例,E型有4例,A型有1例,混合型有136例。而且HBV基因型的分布显示出明显的地区差异。D型在西北地区较常见,沿着北方→黄河→南方→长江的方向,B型所占的比例逐渐增加,而C型所占的比例逐渐减少。HBV基因型还存在着明显的种族分布特点,新疆是一个多民族聚居的地区,这一地区的乙型肝炎患者所感染的HBV基因型独具特色。有学者对新疆地区慢性乙型肝炎患者进行HBV基因型分析显示,各基因型所占比例为C型>B型>C/D混合型,且HBV基因型在汉族和维吾尔族中的分布有统计学差异,C基因型在汉族中常见,C/D混合型在维吾尔族中常见[ 4]。本研究结果显示,在汉族中,C基因型所占的构成比最高,为63.8%。在维吾尔族中,C/D混合型所占的构成比最高,为50.6%,与文献报道基本一致。根据以上研究可以推测不同地区不同民族HBV感染率,流行率及耐药率的不同可能与HBV基因型的差异有关,所以基于中国人的HBV基因特点建立中国人自己的HBV基因库是很有必要的。

HBV突变株是由宿主免疫或抗病毒药物选择出来的。这些突变有的可改变乙型肝炎表面抗原结构,导致免疫学诊断失败;有的可引起耐药,导致抗病毒治疗失败;有的可影响乙型肝炎疫苗的效果,导致主动免疫失败[ 5]。目前拉米夫定和阿德福韦酯作为抗病毒药用于HBV感染所致肝胆疾病的治疗。拉米夫定在使血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)水平正常化、乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg)转换、抑制HBV DNA等方面有效。另外,拉米夫定还可降低并发症,包括肝功能衰竭和肝癌。其主要缺点为耐药突变率较高。与拉米夫定相关的耐药突变主要为rtM204V/I、rtL180M等。阿德福韦酯可以改善组织学、病毒学和生化学参数。它对拉米夫定耐药株有效。与阿德福韦酯相关的耐药突变主要为rtA181V/T、rtN236T等[ 6]。

本研究对常见耐药位点的突变发生情况进行分析,结果显示各耐药位点发生突变的位点数不同,且以多位点突变的情况较为常见。其中,以rtN236T +rtA181V/T+ rtM204V/I 3位点联合变异比较多见。临床上在进行乙型肝炎抗病毒治疗的过程中出现的多重耐药病例就是由于该病毒多个位点变异同时出现于同株病毒的基因组中。如与拉米夫定耐药相关的氨基酸置换位于HBV聚合酶催化区域(C区)的YMDD序列,即rtM204I/V。通常,这些原发性突变株的适应力较差,复制能力不如野生株。持续的抗病毒治疗可导致“补偿性”或“继发性”的突变株产生,从而部分地或完全地恢复病毒的复制力。在有些患者中,一个以上的补偿性突变才能恢复病毒的复制效率。如rtL80I、rtL180M、rtV173L能增加rtM204V突变株的复制效率而被称为rtM204V的补偿性突变[ 7]。本研究中各耐药位点发生突变的位点数不同,且以多位点突变的情况较为常见。这种多位点变异株的产生机制尚不清楚,其与临床的关系如何有待于进一步研究。

本研究还对常见HBV变异类型的基因型构成进行分析,研究结果表明HBV变异类型与基因型无明显的统计学相关性,但C型HBV在各变异类型中所占的比例均最高。C型HBV可能与较差的临床结局相关。如李晓斐等[ 8]报道,HBV基因型之间YMDD变异差异有统计学意义( P<0.05),C基因型在慢性乙型肝炎治疗过程中较B基因型更易发生YMDD变异,引起病毒耐药的产生,给临床治疗增加障碍。有文献显示,C型HBV感染与HBeAg转换延迟及肝硬化和肝癌发病率增加(与B型HBV相比较)有关[ 9]。而本研究显示C型在常见HBV变异类型中所占的比例均最高。可能与C型HBV在这一地区的高流行率有关,但并不排除本地区所研究的HBV在某些重要的分子特征上不同于其它地区。

HBV耐药性的产生与宿主、抗病毒药物及病毒等诸多因素有关,本研究以病毒基因型为着眼点,探讨其与HBV耐药变异的关系,为HBV基因变异的研究提供理论依据。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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