引用本文
于霞, 尚媛媛, 赵立平, 董玲玲, 马异峰, 王晓波, 黄海荣. 分子杂交法快速鉴定结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的初步评价. 2014, 29(10): 1037-1040[YU Xia, SHANG Yuanyuan, ZHAO Liping, DONG Lingling, MA Yifeng, WANG Xiaobo, HUANG Hairong.. Primary evaluation of molecular hybridization method for the identification of Mycobacterium tuberculosis and non-tuberculosis Mycobacterium. Labratory Medicine, 2014, 29(10): 1037-1040]  
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分子杂交法快速鉴定结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的初步评价
于霞, 尚媛媛, 赵立平, 董玲玲, 马异峰, 王晓波, 黄海荣
北京市结核病胸部肿瘤研究所 首都医科大学附属北京胸科医院, 北京 101149

作者简介:于 霞,女,1983年生,硕士,研究实习员,主要从事结核分枝杆菌的实验室诊断和耐药研究。

通讯作者:黄海荣,联系电话:010-89509159。

基金:北京市重大科技攻关项目(D121100003012001);
摘要

目的

评价结核分枝杆菌鉴定试剂盒(分子杂交法)进行分枝杆菌菌种初筛的准确性,并探讨如何快速准确地鉴定结核分枝杆菌复合群(MTC)和非结核分枝杆菌(NTM)混合感染标本。

方法

采用分子杂交法对200株结核分枝杆菌临床分离株进行菌种鉴定。人工制备结核分枝杆菌和胞内分枝杆菌、结核分枝杆菌和脓肿分枝杆菌、结核分枝杆菌和偶发分枝杆菌的混合感染模型,评价基因测序法、芯片法和Hain test在检测分枝杆菌混合感染中的准确性。

结果

以对硝基苯甲酸(PNB)分离鉴定结果为参照,分子杂交法的敏感性和特异性分别为65.12%(65/86)和98.25%(112/114)。对于人工制备的13种不同比例混合的H37Rv和NTM,芯片法和Hain test均可以准确鉴定出混合感染标本中的混合菌种,而基因测序结果表明,H37Rv:偶发分枝杆菌的比例在10%~90%范围内才能区分出混合感染的类型。

结论

分子杂交法对于结核分枝杆菌诊断有较高的特异性,一旦经该法鉴定为NTM,则具有很高的诊断意义。明确标本中存在混合感染后可以采用芯片法或Hain test对临床上高致病的分枝杆菌进行菌种水平的鉴定。

关键词: 结核分枝杆菌; 非结核分枝杆菌; 混合感染; 分子杂交法
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2014)10-1037-04
Primary evaluation of molecular hybridization method for the identification of Mycobacterium tuberculosis and non-tuberculosis Mycobacterium
YU Xia, SHANG Yuanyuan, ZHAO Liping, DONG Lingling, MA Yifeng, WANG Xiaobo, HUANG Hairong.
Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Institute, Beijing Chest Hospital Affiliated to Capital Medical University, Beijing 101149,China
Abstract

Objective

To evaluate the accuracy ofMycobacterial species identification kit (molecular hybridization method), and to investigate the rapid and accurate approaches for the identification of mixed infection caused byMycobacterium tuberculosis complex (MTC) and non-tuberculosisMycobacterium(NTM).

Methods

A total of 200 clinicalMycobacterium isolates were identified by molecular hybridization method. The mixed infection was simulated by the mixture ofMycobacterium tuberculosis andMycobacterium intracellular,Mycobacterium tuberculosis andMycobacterium kansasii,Mycobacterium tuberculosis andMycobacterium fortuitum. The gene sequencing, gene chip array and Hain test were used to evaluate the accuracy ofMycobacterium-mixed infection.

Results

As reference to pnitrobenzoic acid(PNB) tests, the sensitivity and specificity of molecular hybridization method were 65.12%(65/86) and 98.25%(112/114), respectively. Among 13 different proportions ofMycobacterium tuberculosis and NTM, gene chip array and Hain test accurately detected all of the mixed infections. Gene sequencing can only detect the mixed infection caused byMycobacterium tuberculosis andMycobacterium fortuitum at a range from 10% to 90%.

Conclusions

The specificity of molecular hybridization method for the identification ofMycobacterium tuberculosis is high. The kit following the method for NTM has a significant diagnosis value. Once the mixed infection is identified in the culture, gene chip array and Hain test can identify the species of mixed culture for the common pathogenicMycobacterium.

Keyword: Mycobacterium tuberculosis; Non-tuberculosisMycobacterium; Mixed infection; Molecular hybridization method

非结核分枝杆菌(non-tuberculosis Mycobacterium,NTM)病在全球范围内呈现上升趋势,在一些国家和地区发病率和患病率甚至超过结核病[ 1, 2, 3]。我国非结核分枝杆菌病发病率也呈上升趋势, 2000年第4次全国结核病流行病学抽样调查的NTM分离率已达到11.1%[ 4],2010年NTM分离率已达22.9%[ 5]。因此,在日常诊疗工作中,对非结核分枝杆菌病不容忽视。目前,国内临床机构进行结核分枝杆菌复合群( Mycobacterium tuberculosis complex ,MTC)菌种鉴定多采用对硝基苯甲酸(p-nitrobenzoic acid,PNB)分离、鉴别培养的方法。该法以其简便、廉价和相对可靠的特点而广泛使用,然而也存在明显缺点:一是不能鉴定至菌种水平,二是检测时间长。最近,一些基于分子生物学的菌种鉴定方法已广泛应用[ 6],如基于16S RNA、rpoB、16S~23S rRNA 间区序列等基因测序, Mycobacterium CM/AS试剂盒和分枝杆菌菌种鉴定试剂盒(芯片法)以及结核分枝杆菌鉴定试剂盒(分子杂交法)。本研究目的是评价结核分枝杆菌鉴定试剂盒(分子杂交法)进行菌种初筛的准确性,并探讨如何快速准确地鉴定结核分枝杆菌和NTM混合感染标本。

材料和方法
一、菌株来源

200例分枝杆菌临床分离株来源于首都医科大学附属北京胸科医院,菌株收集时间为2010年11月至2011年9月。经PNB初筛鉴定后,结核分枝杆菌114例,NTM 86例。标准菌株H37Rv(ATCC 27294)、胞内分枝杆菌(ATCC 13950)、偶发分枝杆菌(ATCC 6481)和堪萨斯分枝杆菌(ATCC 12478)均为国家结核病临床实验室保留菌株。

二、方法

1.混合感染模型 选取罗氏培养基上生长2~3周的菌落,制备浊度为1个麦氏浊度浓度(相当于3~6×107 CFU/mL)细菌悬液。然后分别将H37Rv与其他3种NTM标准菌株按照如下13种比例进行混合:1∶99、2∶98、10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30、80∶20、90∶10、98∶2、99∶1。人工制备成3种结核分枝杆菌和NTM混合模型:包括结核分枝杆菌和胞内分枝杆菌、结核分枝杆菌和脓肿分枝杆菌、结核分枝杆菌和偶发分枝杆菌。

2.分子杂交法检测 结核分枝杆菌鉴定试剂盒(分子杂交法)为北京万泰生物药业股份有限公司产品(批号:20100301)。该试剂盒采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增和反向分子杂交方法对结核分枝杆菌进行检测和鉴定,靶基因为16 S rRNA。结果判读区包括质控条带、结核分枝杆菌条带和分枝杆菌质控条带,可以对培养物进行结核分枝杆菌或NTM的初步鉴定。

3.芯片法检测 采用分枝杆菌菌种鉴定试剂盒(芯片法,博奥生物有限公司产品,批号:20100101)。对上述混合感染模型进行菌种鉴定,检测方法参照说明书。采用LuxScan 10 K-B微阵列芯片扫描仪和相应的软件进行信号的读取以及结果判读。该试剂盒可检测除了结核分枝杆菌外的16种NTM。

4.Hain test检测 GenoType® Mycobacterium CM/AS试剂盒(Hain life science,德国,货号:E000144)。按照试剂盒要求进行操作,该试剂盒可检测除了结核分枝杆菌外的15种NTM。

5.基因测序法检测 本研究采用3对引物进行测序,包括16S RNA、rpoB、16S~23S rRNA 间区序列。分枝杆菌DNA提取和PCR扩增见参考文献[7]。16S rRNA和 16S~23S rRNA 间区引物见参考文献[6]。rpoB上游引物: TCGATCGGGCACATCCGG;下游引物:CGACCACTTCGGCAACCG。16S RNA 产物约800 bp, 16S~23S间区400~600 bp,rpoB序列为300~320 bp,扩增产物由北京擎科新业生物技术有限公司测序,对比NCBI数据库确定其菌种。

结 果
一、结核分枝杆菌鉴定试剂盒(分子杂交法)对分枝杆菌初筛的敏感性和特异性

在PNB分离鉴定为NTM的86例标本中,分子杂交法检测为NTM 56例,敏感性为65.12%(65/86)。在PNB分离鉴定为MTC的114例标本中,分子杂交法检测为MTC 112例,特异性为98.25%(112/114)。以PNB分离鉴定为参照,阳性预测值为 96.55%(56/58),阴性预测值为78.87%(112/142),分子杂交法的总体符合率为84.00%。见表1。

表1 PNB和分子杂交法MTC与NTM检测结果比较

经PNB分离鉴定为MTC的114株中有2株经分子杂交试剂盒检测为NTM,对这2株菌采用基因测序法进行菌种鉴定,2株均为堪萨斯分枝杆菌。经PNB鉴定为NTM菌株为86株,其中有30株经分子杂交法鉴定为MTC。30株菌株经基因测序法菌种鉴定,包括胞内分枝杆菌16株、鸟分枝杆菌2株、堪萨斯分枝杆菌4株、偶发分枝杆菌1株、戈登分枝杆菌2株、脓肿分枝杆菌3株、MTC/堪萨斯分枝杆菌混合感染1株、MTC/偶发分枝杆菌混合感染1株。

二、3种方法鉴定混合感染模型的结果

对于人工制备的13种不同比例混合的H37Rv和NTM,芯片法和Hain test均可以准确鉴定出混合感染标本中的混合菌种。而基于16S RNA、rpoB、16S~23S rRNA间区基因测序结果表明,在H37Rv与偶发分枝杆菌的比例为10%~90%范围内能区分出结核分枝杆菌和偶发分枝杆菌的混合感染。但对堪萨斯分枝杆菌、胞内分枝杆菌与H37Rv的混合感染鉴定结果不佳。3种混合感染的测序结果见表2。

表2 基因测序对3种人工混合感染模型的测序结果
讨 论

非结核分枝杆菌病发病率不断上升,甚至可能超过结核分枝杆菌的发病率,因此临床上混合感染患者数量也在不断增加,非常有必要关注混合感染的情况。NTM药物敏感性试验与临床治疗间的关联不大[ 8],在一线抗结核药耐药中仅大环内酯类和喹诺酮类具有潜在的抗NTM活性[ 9]。因此,快速、特异的筛选出培养物中的NTM对于患者的治疗非常重要。分子杂交法筛选MTC的特异性为98.25%(112/114)。经分子杂交法鉴定为NTM的58株菌种,经PNB验证后其中56株为NTM,另外2例菌株经基因测序法鉴定为堪萨斯分枝杆菌,这一结果与文献报道相符,部分NTM会对PNB敏感。Giampaglia等[ 10]研究表明,经测序鉴定为NTM 的61例标本中,有1株堪萨斯分枝杆菌和1株海分枝杆菌对500 μg/mL的PNB敏感。

本研究中经分子杂交法鉴定为MTC的142株菌株中有30株经PNB鉴定为NTM。刘冠等[ 11]研究也表明以基因测序(16S rRNA、16~23S rRNA间区序列)为标准,PNB鉴定为NTM的93株菌株中有12株被测序鉴定为结核分枝杆菌。造成这种鉴定结果不一致的主要原因为培养物的混合感染。当然,这也不能排除实验室内的污染。那么什么方法可以快速准确地对混合感染的标本进行鉴定,不同的混合感染比例是否会影响菌种鉴定结果呢?

为了回答上述问题,本研究人工制备已知菌株的混合感染模型来评价不同的诊断方法对混合感染鉴定结果的准确性。对人类有致病性的常见NTM包括鸟胞内复合菌( Mycobacterium avium intracellulare,MAC)、堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌[ 12]。堪萨斯分枝杆菌病在美国仅次于鸟胞内复合菌病,居第2位,在世界其他地区也较常见[ 13]。因此,本研究选择胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌以及堪萨斯分枝杆菌人工制备与结核分枝杆菌混合感染的模型。结果表明基因测序法无法区分结核分枝杆菌与堪萨斯分枝杆菌、结核分枝杆菌与胞内分枝杆菌的混合感染,只能区分结核分枝杆菌和偶发分枝杆菌的混合感染。因为基因测序无法对扩增产物片段大小相同的菌株进行区分,偶发分枝杆菌和结核分枝杆菌在16S~23S间区序列长度差异明显,结核分枝杆菌约为340 bp,偶发分枝杆菌约为410 bp,而其他2种NTM在3个基因的扩增序列长度与结核分枝杆菌相似,因此无法进行混合感染的区分。芯片法和Hain test检测原理为扩增产物与菌种特异的分子探针杂交,当NTM与结核分枝杆菌的比例>1∶99时,即能准确地检测出混合感染的类型。但这2种检测方法也有局限性,仅能检测出临床上常见的16种分枝杆菌,且检测成本较高,很难作为常规检测方法在临床中推广。

分子杂交法对MTC诊断的特异性为98.25%(112/114),阳性预测值为96.55%(56/58)。同时,该法操作简便,仅需普通PCR仪和杂交仪即可,可在4 h内报告结果,且成本较低,一旦经该法鉴定为NTM,则具有很高的NTM诊断意义。结合分子杂交法和PNB分离鉴定结果可以初步判断培养物中是否存在混合感染。明确标本中存在混合感染后可以采用芯片法或Hain test对临床上高致病的分枝杆菌进行菌种水平的鉴定,当混合感染的比例>1∶99,即可成功地检测出混合感染标本的类型,可以更好地指导临床治疗。

本研究存在以下不足:(1)本研究中经PNB鉴定为NTM菌株86株,其中有30株经分子杂交法鉴定为MTC,但由于缺乏多份来自同一患者的培养物,因此无法确认30株混合感染是来自患者体内还是由实验室污染造成;(2)由于上述30株菌株的感染类型和混合比例不确定,在缺乏判读标准的情况下,综合成本效益分析,没有采用Hain test和芯片法进行混合感染的鉴定。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Van Ingen J, Bendien SA, de Lange WC, et al. Clinical relevance of non-tuberculous mycobacteria isolated in the Nijmegen-Arnhem region, the Netherland s[J]. Thorax, 2009, 64(6): 502-506. [本文引用:1] [JCR: 8.376]
[2] Lai CC, Tan CK, Chou CH, et al. Increasing incidence of nontuberculous mycobacteria, Taiwan, 2000-2008[J]. Emerg Infect Dis, 2010, 16(2): 294-296. [本文引用:1] [JCR: 5.993]
[3] Andréjak C, Thomsen VØ, Johansen IS, et al. Nontuberculous pulmonary mycobacteriosis in Denmark: incidence and prognostic factors[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2010, 181(5): 514-521. [本文引用:1]
[4] 全国结核病流行病学抽样调查技术指导组. 第四次全国结核病流行病学抽样调查报告[J]. 中华结核和呼吸杂志, 2002, 25(1): 3-7. [本文引用:1]
[5] 马 玙, 黄海荣. 浅谈非结核分枝杆菌肺病的诊断[J]. 中华结核和呼吸杂志, 2012, 35(8): 564-566. [本文引用:1]
[6] 赵建宏, 李雅静, 温海楠, 等. 非结核分枝杆菌感染的分子诊断研究进展[J]. 检验医学, 2012, 27(3): 155-158. [本文引用:1]
[7] 赵立平, 于 霞, 姜广路, 等. 对BACTETM MGIT960培养报告结果为阴性的培养管中颗粒性物质的研究[J]. 中国防痨杂志, 2013, 35(1): 27-31. [本文引用:1]
[8] Heginbothom ML. The relationship between the in vitro drug susceptibility of opportunist mycobacteria and their in vivo response to treatment[J]. Int J Tuberc Lung Dis, 2001, 5(6): 539-545. [本文引用:1] [CJCR: 2.5]
[9] Van Ingen J, van der Laan T, Dekhuijzen R, et al. In vitro drug susceptibility of 2 275 clinical non-tuberculous Mycobacterium isolates of 49 species in the Netherland s[J]. Int J Antimicrob Agents, 2010, 35(2): 169-173. [本文引用:1] [JCR: 4.415]
[10] Giampaglia CM, Martins MC, Chimara E, et al. Differentiation of Mycobacterium tuberculosis from other mycobacteria with rho-nitrobenzoic acid using MGIT960[J]. Int J Tuberc Lung Dis, 2007, 11(7): 803-807. [本文引用:1] [CJCR: 2.5]
[11] 刘 冠, 宋媛媛, 姜广路, 等. SMIS检测分枝菌酸在分枝杆菌菌种鉴定中的作用[J]. 中华检验医学杂志, 2011, 34(2): 105-110. [本文引用:1]
[12] 马 玙. 关注非结核分枝杆菌肺病的诊断和治疗[J]. 中华结核和呼吸杂志, 2011, 34(8): 566-568. [本文引用:1]
[13] 唐神结, 沙 巍, 肖和平, 等. 非结核分枝杆菌病的研究进展[J]. 中华结核和呼吸杂志, 2012, 35(7): 527-531. [本文引用:1]